茶樹類黃酮-3’,5’-羥基化酶的功能分析.pdf

1、類黃酮3’,5’-羥化酶(flavonoid3’,5’-hydroxylase，F(xiàn)3’5’H)是茶樹黃烷-3-醇合成中的重要酶類。F3’5’H屬于CYP75A亞家族，可以分別催化黃酮、黃烷酮、二氫黃酮醇和黃酮醇轉(zhuǎn)化為3’,4’,5’三羥基化產(chǎn)物。本研究從茶樹的總cDNA和基因組DNA文庫中分離得到茶樹F3’5’H(CsF3’5’H)基因和它的啟動(dòng)子序列。通過分析氨基酸的序列，推測(cè)CsF3’5’H的N段31個(gè)氨基酸(MALDTVFLLRE

2、LSFATLVILITHIFMRSILT)為信號(hào)肽序列。CsF3’5’H與其他物種的CYP75基因進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，該基因與已知的F3’5’H同源性很高，其中同源性最高的基因分別為仙客來(Cyclamen persicum，ACX37698)(83％)、希臘仙客來(Cyclamen graecum，BAJ08041)(82%)和葡萄(Vitis vinifera，BAE47007)(81%)，因此推測(cè)具有F3’5’H酶的功能。另外，C

3、sF3’5’H啟動(dòng)子序列分析結(jié)果表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子和光響應(yīng)元件是CsF3’5’H轉(zhuǎn)錄起始的重要調(diào)控子，并且含有病原體和鹽脅迫應(yīng)答等啟動(dòng)子元件。
　　在克隆基因的基礎(chǔ)上，本文進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)，通過對(duì)茶樹的不同組織及茶葉的不同發(fā)育階段以及不同誘導(dǎo)條件研究分析類黃酮 B環(huán)羥基化相關(guān)基因CsF3’5’H的相對(duì)表達(dá)量。研究結(jié)果表明，CsF3’5’H基因具有組織表達(dá)特異性，該基因在幼嫩的頂芽中表達(dá)非常高，而在根中表達(dá)極低。誘導(dǎo)

4、表達(dá)特異性研究表明在過光照誘導(dǎo)及蔗糖含量顯著提高條件下CsF3’5’H的相對(duì)表達(dá)增強(qiáng)，這與該基因的啟動(dòng)子的分析是一致的。茶樹葉片粗酶液中F3’5’H酶的活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，茶樹葉片的粗酶提取液具有F3’5’H酶的活性。
　　煙草轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)，在CsF3’5’H基因過量表達(dá)的煙草轉(zhuǎn)基因花中檢測(cè)到飛燕草色素衍生物(Delphinin，DEL)(B環(huán)3羥基產(chǎn)物)，而且矢車菊素(Cyanidin，CYA)(B環(huán)2羥基產(chǎn)物)含

5、量顯著提高。從表型上看，轉(zhuǎn)基因煙草的花比野生型(對(duì)照)花色更紅。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CsF3’5’H具有B環(huán)3’,4’-和3’,4’,5’-羥基化作用。
　　另外，本研究開展了CsF3’5’H基因在酵母中功能驗(yàn)證的研究。首先，運(yùn)用密碼子優(yōu)化及信號(hào)肽修飾構(gòu)建了pYES-dest52-VvF3’5’H、pYES-dest52- CzyF3’5’H1(FSI：CsF3’5’H基因與葡萄F3’5’H基因的信號(hào)肽融合)、pYES-dest52- C

6、zyF3’5’H2(FSII)、pYES-dest52-CzyF3’5’H3(FSIII)重組質(zhì)粒，成功的實(shí)現(xiàn)了CsF3’5’H基因在釀酒酵母中的表達(dá)。CzyF3’5’H1(FSI)基因底物特異性(分別以黃烷酮、黃烷醇、二氫黃酮醇、花青素和黃烷-3-醇為底物)研究結(jié)果顯示，4’-羥基黃烷酮(柚皮素，Naringenin，N)為CsF3’5’H酶的最適底物，并且可以有效地轉(zhuǎn)換成3’,4’-和3’,4’,5’-羥基化兩種形式。值得注意的是，