萊氏野村菌侵染相關基因的篩選、遺傳轉化體系的建立及基因功能鑒定.pdf

1、萊氏野村菌[Nomuraea rileyi(Farlow)Samson]是一種重要的昆蟲病原真菌，在田間可以自然感染多種鱗翅目害蟲，引起害蟲域內流行病，在生物防治中起到重要的作用，具有潛在的生物農(nóng)藥應用前景。但萊氏野村菌殺蟲劑也存在防效緩慢、易受到環(huán)境因素的制約和干擾、產(chǎn)品有效期短、質量穩(wěn)定性較差等缺點。因此通過基因工程的手段，利用有效的殺蟲靶標對原有菌株進行改良，構建高效安全而且環(huán)境友好的的殺蟲工程菌已成為當前該領域研究的重中之重。而

2、作為實現(xiàn)該目標的前期工作基礎，尋找有效殺蟲靶標、研究萊氏野村菌侵染害蟲的分子機制以及真菌侵染與害蟲免疫的互作關系、探明殺蟲機理，無論是在闡明萊氏野村菌抵御害蟲免疫機制的基礎理論研究方面，還是在殺蟲靶標基因的現(xiàn)實應用方面都有著重要的意義。
　　論文以研究萊氏野村菌侵染夜蛾科害蟲斜紋夜蛾的分子機理，并提高萊氏野村菌的生防效果為主要目的，嘗試多種方法和途徑展開研究。取得的研究結果如下：
　?、偃R氏野村菌注射侵染斜紋夜蛾血淋巴后，分

3、離獲得處于不同發(fā)育時期的蟲菌體，利用DD-RT-PCR差異顯示技術，共獲得42條差異表達的片段。BlastX比對分析并結合轉錄組分析結果表明，克隆EST片段大小在47-542 bp之間，獲得的差異EST片段涉及真菌抵御昆蟲免疫系統(tǒng)、抗氧化、逃避宿主免疫、電子傳遞、細胞周期控制、壓力反應、砷酸鹽還原、過氧化物膜蛋白、信號轉導、脂肪酸脫氫酶等功能基因。利用 qPCR的方法驗證了各差異基因在不同時期的表達情況。定量PCR結果表明，差異顯示中基

4、因表達變化并不完全與qPCR檢測到的基因表達變化相同。
　?、诒菊撐牟捎?種方法獲得目標基因的全長序列：利用RACE技術擴增差異表達基因的全長；利用FPNI-PCR的方法，以gDNA為模板，迅速擴增差異表達基因片段的上下游序列；另外通過本地BLAST的方法，在轉錄組測序庫中比對得到cDNA序列。利用此類方法獲得了SR-RCI，PI-PLC，MCL1，NrFADS2等基因的cDNA全長、gDNA序列和上下游序列。
　　本論文重

5、點研究了萊氏野村菌感染斜紋夜蛾后顯著上調表達的脂肪酸脫氫酶NrFADS2基因?；蛐蛄蟹治霰砻?，該基因序列中含有三個內含子，開放閱讀框由1758 bp組成。NrFADS2基因編碼585個氨基酸組成的蛋白，含有membrane-FADs-like超家族蛋白保守的結構域，包括N端的Cyt-b5結構域和HPGG保守區(qū)域，以及中間區(qū)域和C末端的delta6-FADs-like結構域。定量PCR試驗表明， NrFADS2基因在萊氏野村菌侵染斜紋夜

6、蛾血淋巴的不同階段誘導表達。
　?、圻z傳轉化體系的建立是基因功能研究的重要前提，利用萊氏野村菌芽生孢子作為遺傳轉化的受體細胞，對轉化體系統(tǒng)的各種參數(shù)進行了優(yōu)化，篩選出了培養(yǎng)基中潮霉素的最適篩選濃度為450μg/mL，優(yōu)化了誘導劑乙酰丁香酮最適誘導濃度為200μM；對比了AGL-1，LBA4404，GV3101，C58等不同農(nóng)桿菌菌株對CQNr01菌株轉化效率，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌菌株 GV3101具最高轉化效率；構建了隨機插入載體pPZP-

7、Ptrpc-Hph和pPZP-Hph-DsRED2，第一次利用農(nóng)桿菌介導的方法成功將潮霉素抗性基因和紅色熒光蛋白導入萊氏野村菌CQNr01芽生孢子中，PCR和Southern雜交結果表明，目標基因已成功整合到萊氏野村菌基因組中，建立了農(nóng)桿菌介導的萊氏野村菌的遺傳轉化體系。
　?、芾秒S機插入載體pPZP-Ptrpc-Hph和pPZP-Ptrpc-Hph-DsRED2，以農(nóng)桿菌介導轉化萊氏野村菌，構建了農(nóng)桿菌介導的萊氏野村菌的隨機插

8、入突變體庫，獲得了豐富的突變子表型，并利用FPNI-PCR獲得了突變子插入位點的側翼序列，此方法對于當前沒有明確基因組信息的萊氏野村菌來說，可以從豐富的表型變化來研究基因的功能，打開了萊氏野村菌正向遺傳學研究的大門。
　?、菰谌R氏野村菌沒有基因組序列背景的條件下，利用FPNI-PCR法迅速擴增目標基因的側翼序列，構建了敲除載體，通過農(nóng)桿菌介導，成功實現(xiàn)了目標基因的定點替換性敲除，建立了萊氏野村菌的基因敲除突變體系。
　?、弈?/p>

9、標基因功能的鑒定離不開基因的回復體系。本論文利用FPNI-PCR的方法克隆了目標基因的啟動子序列，將啟動子和ORF序列插入回復載體，構建成基因回復載體；利用諾爾斯菌素抗性基因Sat1基因作為回復篩選的標記基因，最終確立諾爾斯菌素的最適抑菌濃度為300μg/mL。
　?、叱醪借b定了野生型菌株、敲除菌株和回復菌株之間生理生化的變化和對斜紋夜蛾毒力的變化。研究結果表明，敲除NrFADS2基因影響菌株對脂肪酸的利用能力，降低了菌株抗氧化能