18677.β19β20loop定點(diǎn)突變對(duì)蘇云金芽胞桿菌crylac蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響

1、學(xué)校代碼10542密級(jí)學(xué)號(hào)2鯉旦刁41106813191320loop定點(diǎn)突變對(duì)蘇云金芽胞桿菌CrylAc蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響EffectsofSiteDirectedMutagenesisof』319』320LoopofCrylAcfromB臼cill彩sthuringiensisontheStructureandFunction研究生姓名指導(dǎo)教師姓名、職稱(chēng)易思明學(xué)科專(zhuān)業(yè)微生物學(xué)’———?！狶研究

2、方向——基因工程湖南師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)辦公室二零一二年五月摘要蘇云金芽胞桿菌(BacillusThuringiensis，簡(jiǎn)稱(chēng)Bt)晶體毒素被廣泛用作農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)殺蟲(chóng)劑。這些晶體蛋白被昆蟲(chóng)吞食后經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜機(jī)制，在昆蟲(chóng)中腸通過(guò)與不同受體的順序作用而形成孔洞，破壞了昆蟲(chóng)體內(nèi)滲透壓，導(dǎo)致昆蟲(chóng)裂解死亡。本研究采用寡核苷酸誘導(dǎo)的環(huán)形定點(diǎn)突變技術(shù)，將蘇云金芽胞桿菌晶體蛋白CrylAc結(jié)構(gòu)域III上B19B20loop上的13個(gè)氨基酸分別用丙氨酸

3、替換，構(gòu)建了13個(gè)單點(diǎn)突變子。將它們和野生型菌株及無(wú)晶體突變株cry—B用GTris培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后用顯微鏡觀察晶體形成情況，同時(shí)用SDSPAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)量。結(jié)果除了T557A、L564A、D568A、F569A和cryB外，其余菌株都能形成典型的菱形晶體；除了T557A、L564A、F569A和cryB以外，其余菌株都出現(xiàn)了130KDa蛋白帶。奇怪的是，盡管D568A不能形成菱形晶體，但是卻有130KOa目標(biāo)蛋白帶出現(xiàn)。將突變毒

4、素蛋白和野生型毒素蛋白分別飼喂棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigel。臼)和甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)初孵幼蟲(chóng)，結(jié)果卻呈現(xiàn)很大差異。對(duì)棉鈴蟲(chóng)的生測(cè)結(jié)果顯示，T559A毒力提高186倍，P555A、$560A、L561A毒力分別提高了12％、31％和64％。而T557A、L564A、F569A喪失了毒力的80％以上，其余突變子相對(duì)野生型菌株毒力均有不同程度降低但是仍能明顯抑制棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)。對(duì)甜菜夜蛾生測(cè)結(jié)果顯示，T