口蹄疫病毒OH-99株細胞傳代毒全基因組序列測定及其感染性克隆的構建.pdf

1、口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus,FMDV)引起的偶蹄動物感染的一種烈性傳染病,該病的發(fā)生和流行嚴重危害畜牧業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展,因此,世界各國非常重視對該病的研究.本研究根據(jù)FMDV的基因組核苷酸序列設計并合成了數(shù)對反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的寡核苷酸引物.利用3'-RACE方法從OH/99株細胞傳代毒中擴增得到一7300bp

2、片段,同時,采用常規(guī)RT-PCR技術擴增得到其5'-非翻譯區(qū)(5'-untranslated region,5'-UTR)的S片段和內部核糖體進入位點序列(internal ribosome entry site,IRES),分別克隆至pGEM-T Easy載體中進行序列測定.應用連接PCR的方法將15bp poly(C)序列插入S和IRES兩片段之間,并將連接片段插入pBluescript SK,然后將7300bp片段從pGEM-T

3、Easy載體上切下,插入重組體pBluescript SK中,構建了OH/99株全長cDNA.以全長cDNA重組質粒為模板進行全長PCR擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)Nde Ⅰ消化后,利用噬菌體T7啟動子聚合酶系統(tǒng)啟始合成RNA轉錄本,借助脂質體將RNA轉錄本轉染BHK-21細胞.轉染細胞連續(xù)傳3代后出現(xiàn)典型的細胞病變,通過RT-PCR和電子顯微鏡觀察均確證了感染性病毒粒子的產(chǎn)生.將此基因工程毒接種乳鼠后出現(xiàn)了典型的臨床癥狀,進一步說明了FMDV