J亞群禽白血病病毒AH-J11株全基因組序列分析及其感染性克隆的構(gòu)建.pdf

1、禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由C型禽反錄病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。主要引起雞的消瘦、生長發(fā)育不良和免疫抑制,此病在世界各國雞群中廣泛流行,是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要傳染病之一。由于該病毒能夠通過水平傳播和垂直傳播的兩種方式擴(kuò)散,現(xiàn)階段主要通過淘汰攜帶病毒和患病雞群,從而達(dá)到凈化種群的目的。
　　本研究根據(jù)GenBank上已發(fā)表的經(jīng)典株HPRS-103株和SD07LK1株全基因序列,設(shè)計(jì)并合成11對(duì)特異性引物,

2、通過PCR方法將全基因組分為11個(gè)片段進(jìn)行擴(kuò)增,成功擴(kuò)增出ALV-J安徽分離株AH-J11的全基因序列,并將其分別克隆至pMD18-T載體后進(jìn)行序列測定、拼接,并與GenBank上發(fā)表的不同來源的國內(nèi)外流行毒株進(jìn)行核苷酸及其推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性比較,分析遺傳變異關(guān)系,繪制遺傳進(jìn)化樹。序列分析比對(duì)結(jié)果表明,AH-J11株的全長為7844nt,由3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env和兩端的LTR組成;gag與pol基因?yàn)橄鄬?duì)保守區(qū)域

3、,而env基因?yàn)椴《镜闹饕儺悈^(qū),并且與HPRS-103株的全基因序列同源性最高,達(dá)到97.4％,遺傳親緣關(guān)系最近。研究結(jié)果補(bǔ)充和豐富了ALV-J的基因組信息數(shù)據(jù),為了解ALV-J遺傳變異關(guān)系及構(gòu)建全基因感染性克隆奠定了基礎(chǔ)。
　　其次,采用融合PCR方法將全長11段序列融合至4段J亞群白血病病毒AH-J11株的前病毒cDNA,PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后順次連接至pBluescript II SK+載體上,構(gòu)建該分離株的感染性克隆(pBl

4、ALV-AH-J11),將pBlALV-AH-J11重組質(zhì)粒純化后轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),拯救病毒,然后對(duì)拯救病毒(rALV-J)進(jìn)行增殖培養(yǎng),連續(xù)傳代3次。分別利用RT-PCR、Western-blot和IFA方法,對(duì)拯救病毒進(jìn)行鑒定。結(jié)果證明,本研究構(gòu)建了AH-J11株的全基因組感染性克隆,并拯救出了具有感染性的病毒,為研究J亞群禽白血病病毒的致病機(jī)理和探討新的防制措施等提供了良好的ALV的反向遺傳操作技術(shù)平臺(tái)。
　　最

5、后,為構(gòu)建以J亞型禽白血病病毒(ALV-J)的LTR元件為啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體,將ALV-JLTR克隆至pBluescriptIISK(+)載體中,并在5’LTR和3’LTR之間分別插入報(bào)告基因(eGFP)和新城疫病毒(NDV)的NP基因,得到重組質(zhì)粒pSK-LTR-GFP和pSK-LTR-NP。將上述重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和雞胚成纖維細(xì)胞(CEF),應(yīng)用RT-PCR、westernblot和熒光顯微鏡檢測目的基