含O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、口蹄疫(foot and mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動(dòng)物的一種急性熱性高度接觸性傳染??；羊痘(capripox，CP)是由綿羊痘病毒和山羊痘病毒引起的綿羊和山羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病?？谔阋吆脱蚨痪蛭：?yán)重而被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類重大傳染病。 痘苗病毒(fowl pox viruses，F(xiàn)PV)載體是研究最早和最成功的載體病毒之一，具有宿主范圍廣、增殖滴度高、穩(wěn)定性好、基因組容量大

2、、含多個(gè)非必需區(qū)等優(yōu)勢(shì)，有利于進(jìn)行基因工程操作和插入多個(gè)外源基因，且抗原性穩(wěn)定、免疫原性持久，能夠同時(shí)誘發(fā)體液和細(xì)胞免疫，相對(duì)安全。本文利用我國(guó)廣泛使用的山羊痘疫苗弱毒株(AV41)，以胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK)為突破點(diǎn)，利用病毒在細(xì)胞內(nèi)的同源重組，構(gòu)建表達(dá)O型FMDVP1-2A、3C基因的重組山羊痘病毒弱毒株。構(gòu)建一個(gè)能夠同時(shí)預(yù)防口蹄疫和羊痘病毒的活載體疫苗。 (1)利用RT-PCR分別擴(kuò)增口蹄疫病毒O/China99毒株的

3、P1-2A和3C基因，將P1-2A基因連接到pUC119載體，3C基因連接到pMDl8-T。載體，得到重組載體pUC119-P1-2A，pMD18-T-3C。將重組載體pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHI酶切、重組載體pMDl8-T-3C用.BamHI、NheI酶切，利用酶切所得基因片段P1-2A、3C有共同的BamHI酶切位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基因P1-2A、3C的連接，構(gòu)建重組載體pMD18-T-P1-2A-3C。然后將基因P1-2

4、A-3C與啟動(dòng)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Enhanced Green fluorescent protein，EGFP)表達(dá)的雙向串連痘苗病毒啟動(dòng)子P7.5相連，構(gòu)建了包含真核基因表達(dá)元件和篩選標(biāo)記基因的表達(dá)盒載體p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C。以kpnⅠ為插入位點(diǎn)，將整體表達(dá)盒插入山羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體骨架pUC119-TK之中，構(gòu)建了共表達(dá)FMDV P1-2A-3C基因和綠色熒光蛋白基因的重組山羊痘病毒轉(zhuǎn)移載體pUC119-T

5、K-P7.5-EGFP-P1-2A-3C。(2)病毒轉(zhuǎn)移載體pU119-TK-EGFP-N1-P7.5-P1-2A.3C轉(zhuǎn)染GTPV AV 41株感染的BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后18～24h就可見(jiàn)到特異性熒光。經(jīng)EGFP篩選重組病毒，RT-PCR檢測(cè)FMDVP1-2A-3C基因，抗原捕獲ELISA檢測(cè)FMDV抗原，結(jié)果表明，成功獲得能穩(wěn)定、正確表達(dá)目的蛋白的重組山羊痘病毒株TK+/EGFP+/FMDVP1-2A-3C+/GTPV。