采用轉染血液循環(huán)期原始生殖細胞方法和雞-兔異種動物核移植方法制備轉基因雞.pdf

1、雞的原始生殖細胞(Primordial germ cells,PGCs)是雞各級生殖母細胞和成熟配子共同的祖先,最終發(fā)育分化成卵子或者精子.對雞PGCs進行體外或者體內轉染外源基因操作,再通過后代的篩選,就能獲得轉基因的后代.該論文首先對雞PGCs的遷移路徑進行確定,然后根據(jù)PGCs遷移的位置進行轉染外源基因,最后通過后代篩選獲得了轉基因的后代.同時,采用異種動物核移植和嵌合體制備的方法以期獲得轉基因雞.為此,該文主要進行了以下研究:1

2、,雞PGCs遷移過程中的抗體檢測:應用兩種單克隆抗體MC-480和2C9對PGCs遷移的路徑和規(guī)律進行確定.2,雞胚發(fā)育早期的性別鑒定和血液循環(huán)期PGCs含量的差異:在胚胎發(fā)育早期(13-17期)應用M-PCR進行胚胎性別的早期鑒定.3,胚胎背主動脈注射對胚胎性腺中PGCs數(shù)量的影響:雞胚發(fā)育至14-16期,經背主動脈胚胎微注射DMEM,對雌性胚胎性腺切片PAS染色進行PGCs計數(shù),結果表明正常發(fā)育組4枚胚胎PGCs的平均數(shù)為64±2.

3、97,機械損傷組5枚胚胎的平均數(shù)為51.6±4.23,兩者之間差異顯著(p<0.05).說明背主動脈注射造成胚胎性腺中PGCs的數(shù)量下降,但是其對胚胎的活性沒有影響.4,質粒轉染血液循環(huán)期PGCs制備轉基因雞:雞胚胎發(fā)育至15期,脂質體-質粒DNA復合物進行背主動脈注射,轉染血管中循環(huán)期的PGCs來制備轉基因雞.根據(jù)注射質粒類型的不同分成兩組,注射質粒pEGFP-N1組和注射質粒pEOVALG組,兩組PCR檢測結果表明5日齡、10日齡胚

4、胎和18日齡胚胎的基因組DNA中能夠擴增出GFP基因上471bp的目的片段,注射質粒pEOVALG組性成熟的1只母雞和2只公雞的血液中檢測到外源GFP基因的存在,后代PCR篩選未獲得轉基因的后代.注射質粒pEGFP-N1組4只成年的母雞血液中檢測到外源GFP基因的存在,G0代母雞進行后代PCR篩選的結果表明4只雞將外源基因傳遞給后代的效率從5﹪到53.6﹪.G1的血液樣品經PCR擴增后471bp的目的片段中,測序結果表明目的片段與pEG

5、FP-N1中GFP基因序列完全一致.利用質粒pEGFP-N1中綠色熒光蛋白基因上的471bp的片段作為探針,與G1代的基因組DNA,進行ECL法斑點雜交,27只G1斑點雜交的結果呈陽性,轉基因種系傳遞的效率為19.6﹪(27/138).G1胚胎孵化36h,將胚胎整體取下,熒光顯微鏡下藍光激發(fā),觀察到胚胎整體呈綠色.G1胚胎孵育5d,熒光顯微鏡觀察結果表明腎臟呈綠色.因此,轉染血液循環(huán)期PGCs可以高效獲得轉基因雞.5,雞—兔異種動物核移

6、植獲得重構囊胚:將雞的胚盤細胞注入到兔MⅡ期去核的卵母細胞中,重新構建的雞—兔異種動物克隆胚胎能夠發(fā)育到囊胚階段.當X期雞的胚盤細胞注射到卵時,83.51﹪的重構胚體能夠融合,6.27﹪的融合胚胎能夠進一步發(fā)育,形成與哺乳動物相似的囊胚腔.PCR鑒定和核型分析的結果表明桑椹胚和囊胚的遺傳物質來源于供體雞細胞.應用線粒體特異性引物擴增的結果表明重構胚體中同時具有供體雞和受體兔的線粒體;單克隆抗體MC-480檢測和單克隆抗體2C9檢測呈陽性