雞胚原始生殖細(xì)胞發(fā)育調(diào)控及其機(jī)理的研究.pdf

1、家禽常被用作發(fā)育生物學(xué)研究的動物模型,很多研究致力在更深層次揭示家禽發(fā)育的機(jī)理,尤其是生殖系統(tǒng)的發(fā)育,在內(nèi)源性調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上試圖通過外源性調(diào)控,以提高家禽的繁殖性能。本實驗以艾維因雞胚為材料,分離了胚胎期原始生殖細(xì)胞(primordial germ cell,PGC),并進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng),研究了表皮生長因子(EGF)、雌激素(17β-estradiol)和人參皂甙對PGC增殖的作用及其胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制,同時還探索了維甲酸(RA)在PGC

2、減數(shù)分裂啟動過程中的調(diào)控作用。為改善家禽繁殖性能的營養(yǎng)調(diào)控、轉(zhuǎn)基因家禽的制備提供理論依據(jù)和實驗平臺。1.雞胚PGC的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　 在體視顯微鏡下用玻璃針分離19期3.5d雞胚生殖嵴部位(去除頭突、心臟、尿囊膜和尾部,取后腸前1/3的背外側(cè)組織)或28期5.5d雞胚性腺(從中腎中剝離出來),胰蛋白酶+EDTA消化分散組織,用含10％胎牛血清和10 ng/ml白血病抑制因子(LIF)的KO-DMEM培養(yǎng)液體外共培養(yǎng)PGC和

3、體細(xì)胞的方式建立原代培養(yǎng),然后傳代培養(yǎng)于雞胚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)。同時我們從13～15期雞胚血管中分離提取PGC進(jìn)行原代和飼養(yǎng)層上傳代培養(yǎng)。傳至3～5代后,分離PGC集落,用堿性磷酸酶(AKP)、過碘酸雪夫氏(PAS)化學(xué)反應(yīng)及c-kit、SSEA-1,3,4、EMA-1等免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定PGC,用BrdU摻入法檢測細(xì)胞的增殖活性。并采用RT-PCR方法檢測干細(xì)胞多能性相關(guān)基因(Pou5f1,Sox2,Nanog,AP和Te

4、rt),生殖細(xì)胞特異性基因(c-kit,Vasa和Dazl)和減數(shù)分裂標(biāo)記基因(Stra8和Scyp3)。上述結(jié)果表明PGC-體細(xì)胞原代共培養(yǎng)再傳代于飼養(yǎng)層上培養(yǎng)的模型是可以用于PGC增殖活性調(diào)控的研究。2.EGF對雞胚PGC增殖的影響及其機(jī)理的研究
　　 本實驗研究了EGF對雞胚PGC增殖的影響及其相芙的信號傳遞途徑。結(jié)果表明:經(jīng)過EGF(10～100 ng/ml)處理后,PGC的克隆數(shù)目和面積呈時間和劑量依賴性顯著增加。EG

5、F激活蛋白激酶C(PKC),但是這種作用被EGF受體磷酸化抑制劑AG1478及細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑EGTA所阻斷。此外,EGF還能促進(jìn)細(xì)胞核因子NF-κB(p65)核轉(zhuǎn)位及IκBα的降解,但此效應(yīng)均可被AG1478,EGTA,H7(PKC抑制劑)及SN50(NF-κB特異性抑制劑)所抑制。實驗還表明EGF誘導(dǎo)的PGC促增殖作用分別被AG1478,EGTA,H7及SN50顯著抑制。EGF能促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1/周期蛋白依賴激酶

6、CDK6,Cyclin E/CDK2及凋亡抑制因子Bcl-2的表達(dá):同時,下調(diào)促凋亡因子Bax的表達(dá),抑制細(xì)胞凋亡蛋白酶3/9的活性,并且這些作用都被AG1478,EGTA,H7和SN50阻斷。從而說明EGFR,PKC,NF-κB信號通路介導(dǎo)EGF誘導(dǎo)的DNA合成及抗凋亡作用。以上結(jié)果表明:在體外培養(yǎng)條件下,EGF能過Ca2+/PKC,NF-κB信號途徑促進(jìn)雞胚PGC的增殖,揭示EGF信號通路在調(diào)控雞胚胎生殖細(xì)胞發(fā)育中起著重要的作用。3

7、.雌激素對雞胚PGC增殖調(diào)控機(jī)理的研究
　　 我們研究了17β-雌二醇(E2)對雞胚PGC增殖的影響,以及GPR30介導(dǎo)的具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。結(jié)果表明,向0日齡雞蛋卵黃中注射E2,在5天性腺(27期)中我們發(fā)現(xiàn)SSEA-1陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(注射DMSO)。在體外培養(yǎng)模型中,我們首次發(fā)現(xiàn)第5天性腺PGC表達(dá)GPR30,但并不表達(dá)傳統(tǒng)的雌激素受體ERα和ERβ。1～100 nM E2以劑量依賴和時間依賴模式顯著增加PGC克隆

8、團(tuán)的數(shù)量和面積。Western blot分析顯示E2能激活PGC中Akt活性,GSK3β和β-連環(huán)蛋白的磷酸化水平,這些刺激作用分別被AG1478,LY294002(PI3K抑制劑),KP372-1(Akt抑制劑)和GPR30 SiRNA所阻斷,但是ER抑制劑ICI182,780并沒有明顯的抑制作用。我們還發(fā)現(xiàn)E2對PGC克隆團(tuán)數(shù)目和面積的正調(diào)控作用被AG1478,LY294002,KP372-1和GPR30 SiRNA抑制,但被GPR

9、30激活劑G-1和GSK313抑制劑BIO所提高。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示,E2顯著上調(diào)PGC中細(xì)胞周期蛋白cyclinD1/E。CDK2/6和原癌基因c-fos,c-myc的mRNA豐度,但是這種上調(diào)作用被AG1478、LY294002、KP372-1和GPR30 SiRNA抑制。綜上所述,E2通過GPR30,EGFR,PI3K/Akt和GSK313/β-連環(huán)蛋向信號級聯(lián)反應(yīng)刺激雞胚性腺PGC的增殖。這些發(fā)現(xiàn)提示,E2

10、/GPR30信號在性腺分化前生殖細(xì)胞發(fā)育中扮演重要的調(diào)控作用。4.人參皂甙對雞胚PGC增殖的調(diào)控及其機(jī)制的研究
　　 我們就人參皂甙(ginsenosides)對雞胚PGC的促增殖作用及所涉及的NF-κB信號途徑進(jìn)行研究。從3.5～4天的雞胚中分離PGC,在添加5％胎牛血清和10 ng/ml的LIF的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行原代培養(yǎng)24小時。傳代培養(yǎng)于飼養(yǎng)層上的PGC,用人參皂甙單獨處理,或聯(lián)合PKC抑制劑H7或激活劑佛波酯(PMA

11、)處理24h。此外,通過Western blot分析了NF-κB的核轉(zhuǎn)移和IκBα的降解水平。結(jié)果表明,1～100μg/ml人參皂甙以劑量依賴方式顯著增加了PGC克隆團(tuán)的數(shù)量和面積,但是這種正調(diào)控作用明顯被10-6 M的H7抑制。同時PKC免疫組化結(jié)果顯示,經(jīng)過人參皂甙處理后,PGC克隆團(tuán)中大部分PKC轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上著色,說明PKC已被激活。并且,1～10μg/ml人參皂甙刺激NF-κB(p65)從PGC胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。然而,人參皂甙

12、誘導(dǎo)的NF-κB核轉(zhuǎn)移和IκBα降解作用被10-6M的H7顯著阻斷。以上結(jié)果揭示,人參皂甙能通過激活PKC/NF-κB信號途徑促進(jìn)雞胚PGC的增殖。5.維甲酸(RA)對雞胚PGC減數(shù)分裂的影響
　　 本實驗我們以在體外長期培養(yǎng)的血液PGC為研究對象,探索RA在調(diào)控雞胚胎期生殖細(xì)胞減數(shù)分裂中是否起著保守作用,及其RA能否直接作用于PGC上。結(jié)果表明,在27期雞胚性腺體外培養(yǎng)體系中添加RA能明顯使減數(shù)分裂相關(guān)基因Stra8,Sycp

13、3和Dmc1的mRNA表達(dá)水平上調(diào)。在血液PGC無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)模型中,RA急劇上調(diào)雌性和雄性PGC中Stra8,Sycp3和Dmc1的rnRNA表達(dá)水平。流式分析結(jié)果顯示,PGC經(jīng)過RA處理4天后,29.5％雄性PGC和58.7％雌性PGC處于亞G1期(1n),說明此部分細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入減數(shù)分裂期。吉姆薩染色結(jié)果表明雄性PGC和雌性PGC在經(jīng)RA誘導(dǎo)進(jìn)入減數(shù)分裂偶線期和粗線期的能力不一樣,雌性PGC在RA的誘導(dǎo)下更易進(jìn)入偶線期和粗線期。綜上

14、所述,我們首次報道了RA能直接作用于PGC上從而刺激PGC進(jìn)入減數(shù)分裂期,其中雌性PGC更易進(jìn)入減數(shù)分裂。
　　 以上實驗結(jié)果表明:從不同時期雞胚分離出來的PGC進(jìn)行原代共培養(yǎng),再傳代于雞胚成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上所建立的傳代PGC培養(yǎng)模型可用于PGC增殖和分化調(diào)控的研究,經(jīng)AKP、PAS及c-kit和SSEA-1、3、4免疫細(xì)胞化學(xué)染色等多種方法證實了PGC的原始性。在此模型上發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性因子EGF和外源性植物提取物人參皂甙在PGC體