產(chǎn)酶溶桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的鑒定及功能分析.pdf

1、產(chǎn)酶溶桿菌（Lysobacter enzymogenes）OH11是由本實(shí)驗(yàn)室從辣椒根際土壤中分離得到的一種新型生防菌，屬溶桿菌屬（Lysobacter）、黃單胞科(Xanthomonadaceae)。該菌GC含量較高，有滑行現(xiàn)象，能產(chǎn)生多種胞外酶，包括幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶，此外，產(chǎn)酶溶桿菌可以產(chǎn)生許多重要的此生代謝產(chǎn)物，來抑制或者殺死病原物來發(fā)揮其生防作用，因此，產(chǎn)酶溶桿菌對許多植物病原真菌、卵菌具有很好的

2、拮抗活性。本研究旨在明確產(chǎn)酶溶桿菌OH11是否存在DSF(diffusible signalfactor)型群體感應(yīng)現(xiàn)象，以及DSF型群體感應(yīng)如何發(fā)揮其作用的，與其他黃單胞科細(xì)菌rpfF基因功能的異同。
　　 利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的黃單胞科細(xì)菌的基因組信息，結(jié)合同源比對的方法，首次在產(chǎn)酶溶桿菌OH11中發(fā)現(xiàn)了與DSF合成相關(guān)的rpf（regulation of pathogenicity factors）基因簇。序列和結(jié)果分析表

3、明，產(chǎn)酶溶桿菌OH11的rpf基因與黃單胞細(xì)菌rpf因簇具有較高的同源性和相似的保守區(qū)域，這一結(jié)果表明產(chǎn)酶溶桿菌OH11可能與其他黃單胞細(xì)菌具有相同的功能，為了明確產(chǎn)酶溶桿菌rpf基因簇的功能，我們對其中兩個(gè)重要的基因rpfF和rpfG進(jìn)行了定向敲除。
　　 在黃單胞科細(xì)菌中，DSF型QS系統(tǒng)具有重要的生物學(xué)功能，如:可以調(diào)控病菌在寄主上的致病性，病菌致病因子（如胞外酶和胞外多糖）的產(chǎn)生、生物膜形成、游動性等重要性狀。產(chǎn)酶溶桿菌

4、（Lysobacter enzymogenes）在分類地位上與植物黃單胞菌（Xanthomonas spp.）均屬于黃單胞科（Xanthomonadaceae），但該菌為一種生防細(xì)菌，不具有致病性。在rpf基因簇中，rpfF基因主要負(fù)責(zé)DSF信號分子的合成，在rpf基因簇中發(fā)揮著重要的作用。將產(chǎn)酶溶桿菌OH11的rpfF基因?qū)氲絏cc△rpfF中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rpfFLys基因可以恢復(fù)Xcc由于rpfF基因突變引起的蛋白酶活性下降和DSF

5、產(chǎn)量下降的情況。這一結(jié)果表明，rpfFLys與其他黃單胞科細(xì)菌一樣，是一個(gè)功能性的基因。為了深入了解產(chǎn)酶溶桿菌中rpfF的功能，對其進(jìn)行了敲除和互補(bǔ)。與野生型相比，rpfF基因的突變降低產(chǎn)酶溶桿菌重要抗真菌物質(zhì)——熱穩(wěn)定抗菌因子HSAF的產(chǎn)量和對腐霉的拮抗活性，高效液相色譜和熒光定量PCR與HSAF活性檢測和腐霉拮抗結(jié)果相吻合;降低了WAP的產(chǎn)量，從而降低了對馬鈴薯環(huán)腐病的拮抗。除此之外，對野生型和rpfF突變體進(jìn)行了基因芯片實(shí)驗(yàn)。基因

6、芯片結(jié)果表明rpfF基因缺失會影響337個(gè)基因的表達(dá)。然而，rpfF的突變不改變產(chǎn)酶溶桿菌4種胞外抗菌水解酶的活性。有趣的是，rpfF突變導(dǎo)致產(chǎn)酶溶桿菌菌落表面干燥，但滑行能力提高。
　　 在黃單胞科細(xì)菌中存在著rpfC/rpfG組成的雙組份系統(tǒng)，用于植物黃單胞菌群體感應(yīng)信號分子DSF的感知和傳遞。其中，rpfG負(fù)責(zé)DSF在胞內(nèi)傳遞，具有調(diào)控黃單胞菌致病性的功能。為探索rpfG在產(chǎn)酶溶桿菌中功能，我們以O(shè)H11為研究對象，通過同

7、源比對，在OH11基因組中鑒定出rpfG的同源基因，命名為rpfGLys。利用同源重組技術(shù)，對rpfG基因進(jìn)行了定向敲除，獲得了rpfG的缺失突變株。與野生型相比，rpfG基因的突變降低產(chǎn)酶溶桿菌重要抗菌物質(zhì)——熱穩(wěn)定抗菌因子HSAF的產(chǎn)量和對腐霉的拮抗活性。熒光定量PCR顯示在rpfG突變株中負(fù)責(zé)生物合成HSAF的關(guān)鍵基因PKS/NRPS顯著下調(diào)，與HSAF活性檢測結(jié)果相吻合。然而，rpfG的突變不改變產(chǎn)酶溶桿菌4種胞外抗菌水解酶的活