禽巴氏桿菌基因組的原核表達(dá)及感染血清的吸附.pdf

1、禽巴氏桿菌病又稱為禽霍亂，是由禽巴氏桿菌引起的一種接觸性的敗血性傳染病，該病具有突發(fā)性與流行性，給家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此該病是重點(diǎn)防治的家禽類疾病之一。近年來接種疫苗成為預(yù)防禽巴氏桿菌病的一種有效措施，因此研制高效疫苗已成為研究工作的熱點(diǎn)。
　　引起禽巴氏桿菌病的病原菌是禽巴氏桿菌，又稱為禽多殺性巴氏桿菌，尋找禽巴氏桿菌的致病基因，能夠更好地了解其致病機(jī)理，對有效地防治禽巴氏桿菌病具有重要的意義。致病菌在宿主的體內(nèi)表達(dá)

2、而在體外不表達(dá)的功能基因稱為“體內(nèi)誘導(dǎo)基因”（in vivo-induced gene）。研究表明，這些體內(nèi)誘導(dǎo)基因?qū)Σ≡隗w內(nèi)的生存和致病性有著十分重要的意義。在本研究中，構(gòu)建了禽巴氏桿菌基因組表達(dá)文庫，對重組質(zhì)粒進(jìn)行原核表達(dá)分析，然后利用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)（in vivo-inducedantigen technology，IVIAT），通過感染了病原菌的宿主血清來篩選病原菌在宿主體內(nèi)特異性表達(dá)的病原基因，為新疫苗和新型診斷方法研發(fā)

3、提供新靶標(biāo)，為進(jìn)一步闡明該病的致病分子機(jī)理提供了理論依據(jù)，同時(shí)為深入研究的疫苗研制工作做了鋪墊。
　　本文首先構(gòu)建禽巴氏桿菌CVCC474的基因組表達(dá)文庫：提取禽巴氏桿菌的基因組，用限制性內(nèi)切酶Sau3A I酶切，然后膠回收500-3000bp的基因組DNA片段。限制性內(nèi)切酶BamH I酶切原核表達(dá)載體pET30a/b/c，膠回收線性載體片段，用堿性磷酸酶CIAP去磷酸化。將基因組酶切片段與載體pET30a/b/c連接后，轉(zhuǎn)入大腸

4、桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建了禽巴氏桿菌CVCC474基因組表達(dá)文庫，經(jīng)計(jì)算文庫容量為l.5×104，隨機(jī)挑取9個(gè)克隆進(jìn)行雙酶切實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示隨機(jī)挑選的9個(gè)克隆與所用的表達(dá)載體和目的基因片段大小相符，證明禽巴氏桿菌基因組表達(dá)文庫構(gòu)建的比較成功。然后用堿裂解法提取重組質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，與原核表達(dá)載體pET30a/b/c對照，證明了表達(dá)產(chǎn)物為構(gòu)建的重組質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白。
　　血清的吸附及禽巴氏桿菌基因組表達(dá)文庫的篩選

5、：收集感染禽巴氏桿菌雛雞的血清，分別用體外培養(yǎng)的大腸桿菌BL21（DE3）（含pET30a空載體）和禽巴氏桿菌對雞血清進(jìn)行吸附，目的是去除血清中針對體外表達(dá)的抗原的抗體，采用間接ELISA檢測血清吸附過程中抗體的效價(jià)，結(jié)果顯示血清經(jīng)過吸附后，抗體滴度呈現(xiàn)明顯下降，當(dāng)血清經(jīng)過第三次吸附后，抗體的OD值基本保持不變，證明吸附的效果較好，此時(shí)血清里只剩下了與禽巴氏桿菌在體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的抗原相反應(yīng)的抗體亞群。然后采用菌落原位免疫雜交的方法對基因組