25636.利用啟動子探針載體分離與篩選arthrobactersp.a3冷誘導啟動子_第1頁
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文檔簡介

1、蘭州大學碩士學位論文利用啟動子探針載體分離與篩選Arthrobactersp.A3冷誘導啟動子姓名：趙靜申請學位級別：碩士專業(yè)：生物學植物學指導教師：徐世健20100501@藺晰出害碩士研究生學位論文AbstractTranscriptionisoneofthemostimportantbiologicalprocessesoforganismsPromoterthecorecomponentofgenetranscriptionand

2、regulationcandirectlyaffecttheformationofbiologicalcharacteristicandthebiologicaladaptabilitytotheexternalenvironmentArthrobacterspA3isisolatedfromtheNumberlGlacierpermafrost，whichisastrainofhigh—GCGrampositivepsychrotro

3、phicbacteriumInordertostudyandexplaintheresistantmechanismsofArthrobacterspA3，wehavecarriedouttheresearchONscreeningcold—inducedpromoterinArthrobacterspA3Promoterprobevectorisconstructedinthisstudytoscreencoldinducedprom

4、otersAsaresult，ninecoldinducedpromotersarediscoveredandtheirintensifiesagemeasuredAlltheseresultsestablishthefoundationforsubsequentfunctionalstudyThemajorfindingsare酆follows：(1)Inthepresentstudywehavemovedpromoterfragme

5、ntsfrompART2plasmidandinserted／lmpffpfusiongenewiththreedifferentopenreadingflamesasareportergenetoconstructapromoterprobeplasmidpART2SPAmp—g龜whichCanreplicatenormallyinbothArthrobacterspA3andEscherichiacoli(2)Wehaveextr

6、actedthegenomicDNAfromArthrobacterspA3usingCTABmethodAfterpartialdigestionwithSau3AI，thegenomicDNAfxagmentsareconnected謝mtheprobeplasmidpART2SPAmpg昂whichisdigestedbyBamHIanddephosphorylatedinadvancetocomposethepromoterpr

7、obeplasmidlibraryneplasmidlibraryiselectricallytransformedintoArthrobacterspA3，andatotalofabout900000transformedcoloniesisacquired(3)ComtmctionofarecombinantplasmidpET28一g肇WehaveinducedandexpressedGFPHis6fusionproteinand

8、obtainedrecombinantproteinbyaffinitychromatographyThepurifiedfusionproteinGFPHis6isusedasantigentoimmuniserabbittoproducepolyclonalantibodyThesensitivityandspecificityoftheantibodyaredetectedusingenzymelinkedimmunosorben

9、tassay(ELISA)andWesternblotTheresultsshowthat，thetiterofGFPpolyclonalantibodyaremorethanl：100，000碭eGFPpolyclonalantibodyfragmentispurifiedbyhybridizingtheGFP—SepharoseCL6BwiththeantiseraofGFE(4)Ninecold—inducedhighlyexpr

10、essedunderlowtemperaturepromotersatepreliminaryscreenedwithwholewavelengthmicroplatereaderTheexpressionlevelsofGFPinArthrobacterspA3underlowtemperaturearedetectedwithWesternBlottov耐匆thestrengthsoftheninecold—inducedpromo

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