不同啟動子RNA干擾載體構(gòu)建及驗證.pdf

1、RNA干擾作用(RNA interference，RNAi)是由雙鏈RNA(dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，主要是指dsRNA分子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，特異性降解與之同源的mRNA，從而特異高效地抑制相應(yīng)基因表達(dá)的現(xiàn)象。為建立穩(wěn)定的RNAi系統(tǒng)，本論文選擇不同類型的啟動子構(gòu)建針對RED(紅色熒光)基因的RNA干擾載體，并在HeLa細(xì)胞中驗證本系統(tǒng)的可行性，為實現(xiàn)組織特異RNA干擾提供了技術(shù)支持，并且提供了一個生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因毛用動物的新思路。

2、　　 一RNA干擾載體的構(gòu)建
　　 利用PCR方法分別從pcDNA3.1(+/-)載體克隆CMV啟動子，從pGL3-K5質(zhì)粒克隆角蛋白5(Keratin5，K5)基因啟動子，從綿羊cDNA克隆角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(Keratinassociated protein6.1，KAP6.1)基因啟動子，從小鼠基因組擴(kuò)增超高硫蛋白(Ultra-high-sulfur Keratin Protein，UHS)基因啟動子，經(jīng)pMD19-T載體連

3、接，構(gòu)成中間載體。同時將中間載體和pGenesil-1載體進(jìn)行雙酶切，純化回收，連接，轉(zhuǎn)化?？寺〉脚c目的片段大小相一致的CMV啟動子、K5、KAP6.1和UHS基因啟動子(大小分別為660bp、870bp、1052bp和580bp)。成功構(gòu)建了CMV-pGenesil-1、K5-pGenesil-1、KAP6.1-pGenesil-1和UHS-pGenesil-1過渡載體。從3個shRNA表達(dá)載體上克隆得到shRNA目的片段，將擴(kuò)增得到

4、的目的片段與構(gòu)建成功的過渡載體同時進(jìn)行酶切、純化回收、連接、轉(zhuǎn)化。成功擴(kuò)增到3個shRNA目的片段，大小分別為115bp、116bp和117bp，并將其與構(gòu)建的過渡載體連接。經(jīng)測序分析后，結(jié)果顯示成功構(gòu)建了15個針對RED基因的RNA干擾載體。
　　 二干擾載體表達(dá)的檢測
　　 為驗證構(gòu)建的15個針對RED的干擾載體在HeLa細(xì)胞中是否能抑制RFP(紅色熒光蛋白)的表達(dá)。將15個干擾載體分為6組轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，每組轉(zhuǎn)染

5、實驗重復(fù)4次，以只表達(dá)紅色熒光的CMV-Red質(zhì)粒作為對照組，轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡下觀察RFP的表達(dá)變化，并利用RT-PCR與熒光定量PCR技術(shù)檢測抑制效率。結(jié)果顯示與對照組相比，15個干擾載體都產(chǎn)生了干擾作用，其中抑制效率最高的達(dá)90％以上。將K5驅(qū)動的shRNA1干擾載體轉(zhuǎn)染進(jìn)穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光的綿羊成纖維細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48h后，熒光顯微鏡下檢測紅色熒光和綠色熒光的表達(dá)。綿羊胎兒成纖維細(xì)胞中檢測到綠色熒光的表達(dá)，表明干擾載體轉(zhuǎn)染進(jìn)綿