26803.羅倫隱球酵母脂肪酶純化與ans快速測定脂肪酶熱穩(wěn)定性方法的建立

1、摘要中文摘要脂肪酶作為一種重要的工業(yè)用酶，在造紙、醫(yī)藥、食品、日用化工、能源開發(fā)等領域有著廣泛的研究與應用。作者通過過離子交換柱SepharoseFastFlow純化了羅倫隱球酵母B40(Cryptococcus]aurentiiB40)脂肪酶，獲得了純度超過95％的脂肪酶液，SDS—PAGE電泳顯示其相對分子質(zhì)量約為443KDa，該脂肪酶測序結果顯示N端的12個氨基酸序列為：DF—G—PI—T—I—Y—T—P—P—A。酶學性質(zhì)分析表明

2、該脂肪酶是一種中低溫堿性脂肪酶，較適作用溫度為25。C，最適作用pH為102，Tm為4090。C，能夠催化水解中短碳鏈(12碳以下)的甘油三酯，對混合碳類甘油三酯也有一定的催化作用。分析了不同金屬離子和表面活性劑對該酶的影響，發(fā)現(xiàn)重金屬離子對該酶活性的發(fā)揮有較強的抑制作用，而能促進脂質(zhì)溶解的試劑則能較好地提高酶的催化效用。脂肪酶的熱穩(wěn)定性是脂肪酶的重要性質(zhì)之一，熱穩(wěn)定性好意味著儲存方便，便于運輸，能夠耐受工業(yè)生產(chǎn)應用中的高溫環(huán)境等。尋找

3、一種簡單快速的脂肪酶熱穩(wěn)定性測定法對篩選熱穩(wěn)定脂肪酶的工作有著重要的作用，它能夠大大節(jié)省實驗成本，提高實驗效率，縮短研究到生產(chǎn)實踐的周期。本文報道了一種簡捷、高通量的脂肪酶熱穩(wěn)定性測定法——ANS脂肪酶穩(wěn)定性快速測定方法的建立，該方法可將測定時間由傳統(tǒng)的NaOH滴定法的幾天縮短為幾小時，而且非常適合高通量脂肪酶熱穩(wěn)定性的測定。關鍵詞：羅倫隱球酵母，脂肪酶，熱穩(wěn)定性，ANS，純化，熒光探針，N端測序，酶學性質(zhì)^～l^◆Abstract一_

4、____●—__l自—__l___II●_I_ll—Abstractl[11[IIIIliIll[1111IIY1807161Asoneofthemostwidelyuseindustryenzyme，lipase(EC3113)wasusedinmedicine，food，dailychemicalindustryandotherindustrialfieldsThelipasefromCryptoCOCCUSlaurentiiB40

5、，whichwasreportedasalipase，WaspurifiedbyDEAE。SepharosefastflowionexchangecolumnThepurifiedproteinshowsasinglebandonSDSPAGEwiththemolecularabout443KDaestimatedbySDS—PAGEelectrophoresisTheNterminalsequenceofitisDFGPITIYTPP

6、—ATheoptimumpHandtemperatureare102and25。CrespectivelyTheenzymecouldcatalysetriglyceridebelow12carbonandcouldactivatedbysomereagentslikeSodiumDehycIrocholate，butinhibitedbymanyheavymetalsuchasH礦Lipaseisawidelyusedindustry

7、enzymebutusuallywithpoorthermostabilityOneofthemethodstoimprovethethermo—stabilityisgeneratingmutationsbymutageneslsorDNAShuffiingandselectingtheusefulmutantsfromamutantlibraryItisnecessarytodeveloparapidmethodtomeasuret

8、hethermostabilityoflipasessincethetraditionalreactionactivityanalysisHerewedeveloparapidandhighthroughputANSF1uorescencesignalmeasurementtoevaluatethethermo—stabilityofthelipases：incubatelipaseat2565℃for30min，thencombine

9、020mg／mLlipase，005mM18ANS(8Anilino1naphthalenesulfonicacid，ANS)inthebufferof20mMTrisHCl，100mM500mMNaCl，pH72ReadfluorescencesignalatEX378nm，EM465nmwithfluoreseeneephotometerorplatereaderThencalculatetheTmwithGraphPadPrism

10、50WetestedPEL(Penicilliumexpansumlipase，mutantPEL—ep8一Kll5RandPELep8K202AwithabovemethodandgOtthesimilarTmvaluethatmeasuredbytraditionalmethodKeywords：Lipase，thermostabilityANS，purification，fluorescenceprobe，N_terminalse