擴(kuò)展青霉脂肪酶的定點(diǎn)突變.pdf

1、本課題組已經(jīng)克隆了擴(kuò)展青霉堿性脂肪酶(Penicilliumexpansumlipase，PEL)基因，進(jìn)行了全序列測定，并實現(xiàn)其在真核細(xì)胞畢赤酵母中的高效表達(dá)以及在釀酒酵母中的表達(dá)。為加深對該酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的認(rèn)識，改善其酶學(xué)性質(zhì)，我們嘗試用蛋白質(zhì)工程方法對PEL進(jìn)行改造，主要進(jìn)行了如下幾方面的工作：　　采用重疊延伸PCR的方法獲得突變基因PEL-D92P、PEL-G98A、PEL-N148T、PEL-E113V、PEL-P163G

2、、PEL-P163L、PEL-P163H、PEL-P163W、PEL-P163F、PEL-P163R，實現(xiàn)其在畢赤酵母GS115中的表達(dá)，進(jìn)行突變酶和野生型酶的某些性質(zhì)比較?！　?.突變體PEL-D92P-GS的最適作用溫度提高5℃，熱穩(wěn)定性無明顯變化?？赡苁歉彼岬慕槿耄档蜔o規(guī)則卷曲的柔性，使酶結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，在高溫條件下更適于與底物結(jié)合?！　?.突變體PEL-G98A-GS對橄欖油水解能力發(fā)生急劇下降，幾近為零。推測該點(diǎn)對維持酶

3、的空間構(gòu)象有重要作用。　　3.突變體PEL-N148T-GS的比活約為野生型的115％，最適作用溫度無明顯改變，而熱穩(wěn)定性有所下降?？赡苁且驗樾乱氲臍埢茐牧薃sn與鄰近的殘基或是水形成氫鍵，從而導(dǎo)致了穩(wěn)定性的降低?！　?.突變體PEL-E113V-GS的最適作用溫度有所改善，熱穩(wěn)定性略有下降。推測可能是疏水性較強(qiáng)的氨基酸Val增加了酶分子的表面疏水性，從而提高酶分子的疏水性包裝效率，同時突變對酶分子的空間構(gòu)象影響較大，導(dǎo)致突變體