植物克隆載體pUC38的構(gòu)建和植物組成型表達抗凍肽基因的載體構(gòu)建及對煙草的轉(zhuǎn)化.pdf

1、內(nèi)蒙古大學(xué)碩士學(xué)位論文植物克隆載體pUC38的構(gòu)建和植物組成型表達抗凍肽基因的載體構(gòu)建及對煙草的轉(zhuǎn)化姓名：朱曄榮申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物指導(dǎo)教師：達來2001.6.1植物克隆載體p U C 3 8 的構(gòu)建和植物組【成型表達抗凍肽基因的載體構(gòu)建墾塑望塑壁，匕一、引 言抗凍肽或抗凍蛋白( A m i f f e e z eP r o t e i n ，以下總稱A F P s ) 是一類抑制冰晶生長的蛋白，能以非依數(shù)形式降低水溶液的冰點

2、，對熔點影響甚微，從而導(dǎo)致水溶液的熔點和冰點之間出現(xiàn)差值，該差值稱熱滯活性I l 】。自從1 9 7 6年，H e w 等從生活在北美海域的美洲擬鰈血清中分離出這種具有熱滯活性的熱滯蛋白以來，不但已經(jīng)在魚類發(fā)現(xiàn)五類A F P s ，而且在很多細菌、真菌、越冬節(jié)肢動物及植物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)A F P s ，說明A F P s 在生物界普遍存在，在生物適應(yīng)低溫生存中起著重要的作用。目前已在多種植物體內(nèi)提取純化出A F P s [ 2 —1 ，并且

3、克隆到植物內(nèi)源A F P s 基因【4 ～l 。隨著對其研究的展開，加上轉(zhuǎn)基因植物和植物冷誘導(dǎo)研究的深入，為摸索植物的抗凍生理，進而為提高植物的抗寒性提供了基礎(chǔ)。1 9 9 2 年本實驗室從加拿大引進了冬鰈A F P 的e D N A 克隆p C T 5 { 6 J 。經(jīng)P C R 擴增的抗凍肽基因構(gòu)建到雙元載體p G A 6 4 3 中，并轉(zhuǎn)化煙草，發(fā)現(xiàn)冬鰈抗凍肽基因的表達并不理想【78 1 。對冬鰈A F P 結(jié)構(gòu)分析，推測可能與其

4、自身特性有關(guān)，所以我們根據(jù)有利于在植物中表達的特點，對冬鰈A F P 基兇進行改造，特設(shè)計合成了帶有甘薯( I p o m o e ab a t m a s ) 塊根主要貯藏蛋白S p o r a m i n A 信號肽的抗凍肽基因單體、四聯(lián)體和八聯(lián)體。并將它們分別克隆在p G E M ．3 z f f ．) 載體中，經(jīng)測序證實合成及構(gòu)建成功【9 J 。我們在對抗凍肽基因進行改造的同時，也在考慮構(gòu)建有利于植物中高效表達的載體。本室已成功

5、構(gòu)建了在大豆熱休克啟動區(qū)P 0 5 p 調(diào)控下，與G U S 融合表達的抗凍肽基因的誘導(dǎo)型表達載體【l 0 1 ，以研究抗凍肽基因在誘導(dǎo)型啟動區(qū)調(diào)控下表達的條件。本實驗是構(gòu)建組成型表達載體。以雙元表達載體p B i n 4 3 8 來構(gòu)建，但我們對于p B i n 4 3 8 來說，只知道拷貝數(shù)低，分子量較大，約有1 4 k b ，不容易操作，在R B 和L B 序列間有N P T I I 、C a M V 3 5 S 啟動區(qū)和n o