小黑楊FT-like基因的克隆、原核表達(dá)及植物超表達(dá)、RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、林木通常經(jīng)過幼齡期的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)后，在一系列的內(nèi)、外因素（如春化等）的作用下，進(jìn)入開花期的生殖生長(zhǎng)階段，隨即其營(yíng)養(yǎng)生殖會(huì)減緩，甚至停滯，即便進(jìn)入滯長(zhǎng)期。FT基因編碼MADS-box蛋白，受CO、SOC1、AGL24等基因激活或受FLC等基因抑制后，最終激活花分生組織特異性基因AP1和LFY，促進(jìn)植物開花。因此，若可以使FT基因在楊樹中表達(dá)量下降，便可能會(huì)推遲其開花，保持較長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（童期），提高樹木的生長(zhǎng)量，就可能會(huì)大大增加木材產(chǎn)量。相

2、反，若使FT基因過量表達(dá)，可能會(huì)促進(jìn)楊樹提前開花，可以加速育種進(jìn)程，縮短育種周期。
　　 從小黑楊葉片中成功提取出總RNA，并克隆獲得525bp的cDNA片段，該片段的測(cè)序結(jié)果與擬南芬AtFT基因進(jìn)行同源性比對(duì)，相似性高達(dá)70％以上，為小黑楊FT-like基因，命名為PnFT1。利用傳統(tǒng)的酶切、連接的載體構(gòu)建方法將克隆得到的PnFT1插入到pET-52b的多克隆位點(diǎn)上，獲得PnFTl-pET-52b重組載體。對(duì)PnFT1基因進(jìn)行

3、稀有密碼子預(yù)測(cè)分析，PnFT1基因中有24.5%的密碼子為大腸桿菌稀有密碼子，為保證PnFT1基因在大腸桿菌中正常表達(dá)選取RosettaTM菌株為大腸桿菌表達(dá)型菌株。攜帶PnFTl-pET-52b重組質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，獲得菌體總蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)分析，獲得的PnFT1重組蛋白的分子量為28KD，且過量表達(dá)的PnFT1重組蛋白是以包涵體形式存在的。將PnFT1融合蛋白經(jīng)包涵體純化、電洗脫純化、透析、沉淀

4、后，獲得的蛋白質(zhì)樣品，濃度可達(dá)到10ug/ul，純度達(dá)到90%以上，且不含有SDS、尿素、考馬斯亮藍(lán)染料等不利于抗體制備的試劑，完全達(dá)到制備多克隆抗體的蛋白質(zhì)樣品標(biāo)準(zhǔn)，制備多克隆抗體。為利用反向遺傳學(xué)技術(shù)進(jìn)行PnFT1基因的功能基因組學(xué)的研究，分別應(yīng)用傳統(tǒng)的載體構(gòu)建和In-fusion技術(shù)將PnFT1基因構(gòu)建到植物超表達(dá)載體pROK II和植物RNAi表達(dá)載體pFGC5941上，已獲得PnFTl- pROK II和PnFTI(F)-pF