28832.蛋白質(zhì)折疊—去折疊過程中間體的實驗研究

1、東南大學博士學位論文蛋白質(zhì)折疊—去折疊過程中間體的實驗研究姓名：瞿鵬申請學位級別：博士專業(yè)：生物醫(yī)學工程指導教師：陸祖宏20100101東南大學博士學位論文程。發(fā)現(xiàn)了兩種變性中問體。用“相圖”的方法進一步證實了這兩種中間體的存在。在鹽酸胍誘導的豬胰蛋白酶的變性過程中至少存在兩個中間體。首先，在～18M鹽酸胍處，胰蛋白酶轉(zhuǎn)化成一個分子內(nèi)移動性較低的熔融球。在此狀態(tài)下，蛋白質(zhì)分子沒有了三級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)部分消失。色氨酸周圍的微環(huán)境變化很小。

2、檢測不到明顯的ANS熒光。在～39M鹽酸胍處，胰蛋白酶轉(zhuǎn)化到一個前熔融球狀態(tài)。轉(zhuǎn)化后，蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)完全消失，二級結(jié)構(gòu)也大部分消失。內(nèi)源熒光發(fā)生明顯的紅移，熒光偏振度降低。當鹽酸胍的濃度大于40M時，胰蛋白酶完全變性。3光譜技術(shù)研究6一巰基鳥嘌呤和牛血清蛋白之間的相互作用用紫外吸收光譜、CD光譜和熒光光譜研究了6一巰基鳥嘌呤(6TG)和BSA之問的相互作用。6TG對BSA的熄滅是靜態(tài)熄滅過程。用熒光熄滅方法計算出T者之間的結(jié)合位點

3、數(shù)和結(jié)合常數(shù)。熱力學參數(shù)，塒o，AGo和叢o，指示6TG和BSA之間的作用是熵驅(qū)動的，疏水作用力在結(jié)合過程中發(fā)揮著最重要的作用。根據(jù)Forster無輻射能量轉(zhuǎn)移理論，供體(BSA)矛n受體(6TG)之間的距離被估算。同步熒光光譜顯示6TG結(jié)合到BSA上后，蛋白質(zhì)中色氨酸周圍的極性升高，疏水性降低。熒光熄滅主要來源于色氨酸熒光而是不是酪氨酸熒光。CD光譜顯示，隨著6TG結(jié)合牛血清蛋白，蛋白質(zhì)分子中的a螺旋含量逐漸降低。6TG和BSA結(jié)合后

4、，CD光譜的形狀并沒有發(fā)生大的變化，說明該藥物分子結(jié)合在BSA上后，蛋白質(zhì)分子的二級機構(gòu)依然以0【螺旋為主。4脲和鹽酸胍對6一巰基鳥嘌呤和牛血清蛋白相互作用的影響用熒光光譜的方法研究了脲和鹽酸胍存在和不存在兩種情況下6TG和BSA之間的相互作用。天然態(tài)BSA的熒光光譜只在338nlTI處有個峰；而變性態(tài)的BSA分別在304306nrll和348nlTl處呈現(xiàn)出兩個波峰。后者隨著變性劑濃度的增加逐漸紅移。BSA分子乃04和F34s的變化反

5、映出，隨著變性劑濃度的增加，酪氨酸熒光對總熒光強度的貢獻越來越大。6TG無論是對天然態(tài)的還是變性態(tài)的BSA都有熄滅作用。在變性念的BSA中，6TG對BSA的熄滅作用主要來源于酪氨酸熒光而不是色氨酸熒光。隨著變性劑濃度的升高，6TG和BSA之間的熄滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)都降低。光譜分析顯示，在兩種變性劑環(huán)境中，6TG對BSA都有一定的抗變性效果。隨著變性劑的加入，6TG對BSA的抗變性能力降低。5近生理濃度的脲對核黃素與牛血清蛋白結(jié)合作用的影響

6、用CD光譜和熒光光譜法研究了近生理濃度的脲存在和不存在兩種情況下核黃素和牛血清蛋白之間的相互作用。一定濃度的核黃素結(jié)合在牛血清蛋白分子上可以引起B(yǎng)SA分子結(jié)構(gòu)的伸展，二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)減少。近生理濃度下的脲可以誘導核黃素變性后的牛血清蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)得以部分恢復。在近生理條件下的脲存在時，核黃素對牛血清蛋白的熄滅常數(shù)(墨)以及供體牛血清蛋白和受體核黃素之間的距離(，)增大了。相反地，結(jié)合常數(shù)(局)和結(jié)合位點數(shù)∽)減小了。在近生理