36678.核糖體展示scfv文庫(kù)的構(gòu)建及其在抗克倫特羅抗體篩選中的應(yīng)用

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文核糖體展示ScFv文庫(kù)的構(gòu)建及其在抗克倫特羅抗體篩選中的應(yīng)用姓名：蘇存舉申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：陳福生高志賢20080601核糖體展示ScFv文庫(kù)的構(gòu)建及其枉抗克倫特羅抗體篩選中的應(yīng)用(I)用引物ScFv模板的上游引物T7B和下游引物PRDR擴(kuò)增ScFv文庫(kù)得到1100bp的目的片斷，證明文庫(kù)可擴(kuò)增性良好。(2)將抗體文庫(kù)連接PEASYT3載體，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示抗體序列各不相同，不存在中止

2、密碼子和致死突變，多樣性良好。(3)用PromegaT7RiboMAXExpressLargeScaleRNAProductionSystem將DNA文庫(kù)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到500bp的mRNA單鏈目的條帶，將文庫(kù)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到1100bp的特異目的條帶，證明文庫(kù)具有反轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄活性。(4)采用TranscendTMNon—RadioactiveTranslationDetectionSystems鑒定文庫(kù)蛋白表達(dá)活性，本系統(tǒng)使翻譯產(chǎn)物生物

3、素化，抗體采用堿性磷酸酶標(biāo)記鏈親和素。結(jié)果顯示40kD左右處有條帶，Western印跡結(jié)果顯示該產(chǎn)物為抗CL抗體。3利用文庫(kù)篩選抗CL抗體將構(gòu)建的ScFv文庫(kù)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄翻譯后，以人工抗原CLBSA為靶標(biāo)，利用固相親和方法篩選抗觀抗體，通過改變Mg“濃度將篩選得到的單鏈抗體一核糖體一mRNA(ARM)聯(lián)體解離，得到相應(yīng)的mRNA，經(jīng)過RTPCR得到篩選后的DNA文庫(kù)。通過多輪生物淘篩，ScFv高度特異富集，經(jīng)過測(cè)序比對(duì)最終獲得抗CL抗體

4、序列。將該抗體序列在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)得到特異蛋白條帶，經(jīng)WB印跡驗(yàn)證該蛋白為抗CL抗體。4對(duì)CL抗體靈敏度和特異性的初步分析優(yōu)化的競(jìng)爭(zhēng)ELISA條件為：用濃度為20g／mL的CL—BSA4“C包被過夜，抗體以pH74的PBST緩沖液稀釋為1：4000，競(jìng)爭(zhēng)抗原與抗體混勻37℃反應(yīng)1h后，加入酶標(biāo)板中再反應(yīng)1h，然后加入酶標(biāo)二抗(以PBST作1：1000稀釋)37℃反應(yīng)1h，加底物37“C反應(yīng)20min，用2mol／LH2s04終止