哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫(kù)構(gòu)建及靶向ErbB3 ScFv篩選.pdf

1、抗體藥物是目前研究和應(yīng)用最為廣泛的一類生物技術(shù)藥物,是腫瘤、感染、炎癥等疾病的重要治療手段。全人源抗體藥物因其免疫原性低,在迄今美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(American Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)上市的抗體類藥物中(僅指含抗體可變區(qū)的抗體藥物)占有很大的比重,已成為未來(lái)臨床應(yīng)用抗體發(fā)展的趨勢(shì)。目前,全人源抗體候選序列主要通過(guò)噬菌體展示文庫(kù)篩選獲得,再改構(gòu)到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行大量生產(chǎn)表達(dá),這使“

2、萬(wàn)里挑一”獲得的抗體在從原核到真核的過(guò)程中面臨很大的親和力改變等風(fēng)險(xiǎn)。相比之下,基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體庫(kù)篩選出的候選抗體將原核表達(dá)系統(tǒng)篩選抗體具備的風(fēng)險(xiǎn)和弊端大大降低。目前,哺乳動(dòng)物細(xì)胞抗體庫(kù)技術(shù)報(bào)道有限,在國(guó)內(nèi)外仍處于起步階段,具有很大的學(xué)術(shù)意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究擬構(gòu)建真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型單鏈抗體(single—chain antibody fragment,ScFv)庫(kù),并選取表皮生長(zhǎng)因子受體-3(v-erb-b2 avian er

3、ythroblastic leukemia viral oncogene homolog3,ErbB3)為靶點(diǎn)進(jìn)行ScFv抗體篩選以驗(yàn)證本抗體庫(kù)的有效性。
　　第一部分構(gòu)建真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型ScFv抗體庫(kù)。
　　本研究首先收集包括多種病種及健康志愿者在內(nèi)共120例志愿者外周血淋巴細(xì)胞,通過(guò)提取總核糖核酸(Ribonucleic Acid,RNA)并反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)脫氧核糖核苷酸(complementary Deoxyrib

4、onucleic acid,cDNA),作為擴(kuò)增人抗體庫(kù)可變區(qū)基因的模板。參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)28對(duì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增重鏈可變區(qū),設(shè)計(jì)16對(duì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)。利用上述引物通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)擴(kuò)增、膠回收分別獲得重鏈抗體可變區(qū)(Heavy-chain variable region,VH)和輕鏈抗體可變區(qū)(Light-chain variable region,VL)庫(kù)。通過(guò)重疊PCR,

5、以(G4S)3的linker將VH及VL連接成單鏈抗體ScFv。通過(guò)Sfi I及Sal I雙酶切位點(diǎn)將ScFv連接至載體 pDisplay,構(gòu)建重組質(zhì)粒庫(kù) pDisplay-ScFv。隨機(jī)挑選質(zhì)粒庫(kù)pDisplay-ScFv單克隆并進(jìn)行測(cè)序,并將VH及VL基因在IgBlast-IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示其均為有活性的人免疫球蛋白可變區(qū)基因,從而驗(yàn)證抗體庫(kù)的有效性、多樣性、庫(kù)容量(pDisplay-ScFv質(zhì)粒庫(kù)的庫(kù)容量約為107

6、)。將質(zhì)粒庫(kù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中,培養(yǎng)60 h后收細(xì)胞,利用ScFv蛋白C端帶有的myc標(biāo)簽,用FITC標(biāo)記的抗myc抗體對(duì)其進(jìn)行流式分析實(shí)驗(yàn),以確定該質(zhì)粒庫(kù)能夠得到有效表達(dá)于細(xì)胞表面(結(jié)合轉(zhuǎn)染效率,表達(dá)效率約為20％)。另外,還收集轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞,同樣利用myc標(biāo)簽對(duì)其進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證其抗體庫(kù)表達(dá)蛋白大小的正確性(約為26 kDa)。因此,我們成功構(gòu)建了一個(gè)具有一定多樣性、有效性,并將ScFv抗體表達(dá)于

7、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的展示型人源ScFv抗體庫(kù)。
　　第二部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型ScFv抗體庫(kù)的驗(yàn)證
　　近期研究證明,酪氨酸激酶表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一的ErbB3,是表皮生長(zhǎng)因子受體-1(epidermal growth factor receptor,EGFR/ErbB1)、表皮生長(zhǎng)因子受體-2(v-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog2

8、,ErbB2)抗體藥物臨床應(yīng)用產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵因素,此外還直接參與介導(dǎo)多種ErbB3過(guò)表達(dá)腫瘤,如人骨肉瘤、黑色素瘤等的發(fā)生、惡化。以 ErbB3為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)是近年的熱點(diǎn)。在該部分研究中,我們擬基于前期構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的展示型人源ScFv抗體庫(kù),篩選ErbB3 ScFv抗體以驗(yàn)證該抗體庫(kù)的有效性和實(shí)用性。
　　首先構(gòu)建ErbB3的胞外區(qū)(extracellular domain,ECD)蛋白及胞外配體結(jié)合區(qū)(recept

9、or ligand-binding domain,RLD)蛋白用于篩選ScFv抗體。利用原核表達(dá)系統(tǒng),將 ErbB3的胞外區(qū) ECD基因和胞外配體結(jié)合區(qū) RLD基因分別構(gòu)建至pET-28a(+)和pGEX-KG原核表達(dá)載體。通過(guò)菌液PCR、測(cè)序篩選陽(yáng)性單克隆。將陽(yáng)性單克隆轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)菌BL(DE3)中進(jìn)行表達(dá)并純化。將純化后的ECD蛋白和RLD蛋白標(biāo)記熒光素異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC

10、);通過(guò)FITC標(biāo)記的抗原蛋白利用流式細(xì)胞分選技術(shù)(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS)從文庫(kù)中篩選靶向ErbB3的特異性抗體,并對(duì)其親和力進(jìn)行初步檢測(cè)。
　　為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的可行性,我們選取PubMed公布的ErbB3 ECD ScFv(噬菌體抗體庫(kù)中篩選獲得)序列,并將其構(gòu)建到 pDisplay載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pDisplay-ErbB3 ScFv并混入到質(zhì)粒庫(kù)中作為陽(yáng)性對(duì)照。我

11、們分別用10 nM、2 nM、0.8 nM標(biāo)記后蛋白進(jìn)行三輪流式分選,每輪篩選30 ml細(xì)胞,細(xì)胞密度為1×106/ml。第三輪篩選結(jié)束隨機(jī)挑選單克隆測(cè)序,在測(cè)序得到的35個(gè)單克隆序列中,候選序列22號(hào)出現(xiàn)9次,候選序列31號(hào)出現(xiàn)5次,陽(yáng)性對(duì)照及候選序列20號(hào)均出現(xiàn)3次,候選序列9號(hào)出現(xiàn)2次,其余均出現(xiàn)1次。之后利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)候選序列22號(hào)、候選序列9號(hào)及陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行初步親和力測(cè)定,結(jié)果顯示候選序列22號(hào)親和力為0.72 nM,候選序

12、列9號(hào)親和力為1.72 nM,陽(yáng)性親和力為0.76 nM。同時(shí),在轉(zhuǎn)染后60 h,對(duì)候選ErbB3 ScFv與細(xì)胞系A(chǔ)549中與細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的ErbB3進(jìn)行激光共聚焦共定位實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示細(xì)胞內(nèi)源表達(dá)的ErbB3在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上均存在,外源蛋白ErbB3 ScFv主要定位與細(xì)胞膜,與預(yù)期展示效果一致。
　　綜上所述,本研究成功構(gòu)建具有一定庫(kù)容量、多樣性及有效性的真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示型人源ScFv抗體庫(kù),并基于該抗體庫(kù)成功篩