棉花遺傳轉(zhuǎn)化及體細(xì)胞無(wú)性系變異研究.pdf

1、西南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文棉花遺傳轉(zhuǎn)化及體細(xì)胞無(wú)性系變異研究姓名：郭余龍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：作物遺傳育種指導(dǎo)教師：李名揚(yáng)裴炎20031101西南農(nóng)業(yè)人學(xué)博士學(xué)位論文調(diào)OD600到04左矗，感染20rain，24～25℃暗培養(yǎng)3d真接用含Km100mg／L的MSBIAA05mg，LKT01111JL的培養(yǎng)基篩選抗性愈傷組織，體胚誘導(dǎo)和成熟階段也加入Kinl00mg／L。再生植株的GUS染色率在90％以上。下胚軸農(nóng)轷菌轉(zhuǎn)化；以有GUS基因

2、瞬時(shí)表達(dá)的外植體百分?jǐn)?shù)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究不同豐才料對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性發(fā)現(xiàn)子葉外植體晟敏感，下胚軸次之，胚根較差。供試的6個(gè)品種都能被農(nóng)桿菌感染，但敏感性有差異。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基用MSB24DO1mg／LKT0Im鼬L優(yōu)于MSBIAA05mg／LKT0Im∥L。只有當(dāng)使用冀棉14體胚苗種子作外植體時(shí)獲得了轉(zhuǎn)基因植株。萌發(fā)前的培養(yǎng)階段可以一直加入Kml00m∥L?？剐灾仓耆~片GUS染色呈陽(yáng)性。3抗病基因?qū)О嗣藁ㄒ源?39胚性愈傷組織為受體，

3、用基因槍法導(dǎo)入DSB基因，獲得了4個(gè)經(jīng)PCR驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因株系：以川棉239莖尖為受體。用基因槍法導(dǎo)入CEMA基因，獲得3株轉(zhuǎn)基因嵌臺(tái)植株；應(yīng)用胚性愈傷組織農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，導(dǎo)入AFPSPCEMA雙價(jià)基因，共獲得6個(gè)抗性細(xì)胞系，再生抗性植株28株。Southem雜交鑒定表明，AFP基因已經(jīng)整合進(jìn)棉花基因組：用下胚軸農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入AFPCHI雙價(jià)基因，共獲得抗性細(xì)胞系10個(gè)、再生抗性植株100余株，CHI基圊的鱧臺(tái)經(jīng)PCR擴(kuò)增證實(shí)：以下胚軸和

4、胚性愈傷組織為受體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入SPCEMACHI外源基因，獲得抗性系29個(gè)，抗性植株200余株，CHl基困的齄合經(jīng)PCR擴(kuò)增證實(shí)。4轉(zhuǎn)CEMA基因棉花的表型轉(zhuǎn)CEMA基因棉花呈嵌合表型。在表型不正常的枝條上，pi片扭曲畸形，出現(xiàn)灰綠色與綠色相間的花葉，花器官發(fā)育異常無(wú)花粉，人工授粉不能結(jié)實(shí)?；ㄈ~區(qū)的葉綠素含量降低20％，葉肉組織細(xì)胞局部缺損，維管柬系統(tǒng)退化。葉片灰綠區(qū)葉肉細(xì)胞的次生壁明顯增厚局部區(qū)域吞噬現(xiàn)象明顯葉綠體內(nèi)基粒片層數(shù)

5、目較少，嗜餓小體明顯較多。類囊體腔不明顯。5棉花體細(xì)胞無(wú)性系變異的幾個(gè)特征棉花體胚的形態(tài)特征豐富。擬南芥胚胎發(fā)育突變體丈多能在棉花體胚中找到形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的對(duì)應(yīng)物。我們根據(jù)萌發(fā)體胚各器官的有無(wú)和位置，將體胚分為缺失增多型、異位型、融合型以及正常體胚。莖端分生組織缺損和頂部缺失所占比例最高約為70％。只觀察到根的異位，占7％；子葉融合占4％。兩生植株的性狀變異豐富，不育株的比例隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)I5年時(shí)，不育株率達(dá)90。

6、100％。因此。遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)應(yīng)盡量縮短培養(yǎng)時(shí)間。用體胚苗所結(jié)種予進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)。沒(méi)有出現(xiàn)第一輪培養(yǎng)時(shí)所發(fā)生的變異傳遞下米，造成變異累積的現(xiàn)象，在6個(gè)月以內(nèi)再生的植株，100％可育，因此體胚苗種子可用作轉(zhuǎn)基因的受體材料。對(duì)IAA、ZR、ABA和GA的測(cè)定表明，冀棉14再生植株的內(nèi)源激素水平存在差異，與對(duì)照比有的升高，有的降低，無(wú)明顯趨勢(shì)。刖95對(duì)SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，4對(duì)引物檢測(cè)出著異，差異表現(xiàn)為帶的增加或位置變化。6棉花花變異休(ck1)的形態(tài)