棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力比較及ipt基因的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、棉花體細(xì)胞培養(yǎng)和植株再生技術(shù)是進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化、體細(xì)胞雜種創(chuàng)造等技術(shù)的必要條件，利用遺傳工程改良棉花品種是目前棉花遺傳改良研究的一個(gè)熱門領(lǐng)域，它能有效打破物種間的界限，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物、植物和微生物間基因資源的相互利用，并可以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)性狀的定向變異，同時(shí)能大大縮短育種年限、加快育種進(jìn)程。但當(dāng)前棉花生物技術(shù)研究仍然存在著很多障礙，如棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的基因型依賴性強(qiáng)、棉花組織培養(yǎng)周期長、體胚發(fā)生率低、基因遺傳轉(zhuǎn)化效率低、再生植株結(jié)實(shí)困

2、難等等，這些問題已經(jīng)成為棉花組織培養(yǎng)、棉花生物技術(shù)、棉花功能基因的驗(yàn)證研究領(lǐng)域的障礙。本研究內(nèi)容主要涉及棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生的調(diào)控，不同生態(tài)區(qū)棉花品種體細(xì)胞胚胎發(fā)生及再生能力比較；不同基因型海島棉體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力研究；高效棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立；ipt基因的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得；同時(shí)對轉(zhuǎn)基因引起的棉花性狀變異的規(guī)律進(jìn)行初步研究，為轉(zhuǎn)基因棉花育種提供理論指導(dǎo)。取得的主要研究結(jié)果如下： 1．在陸地棉愈傷組織誘導(dǎo)階段，適宜濃度的

3、2,4．D+KT和IBA+KT激素組合均能高效誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，其最優(yōu)激素配比為0.1 mg/L 2,4.D+0.15 mg/L KT和0.5mg/LIBA+0.15 mg/LKT。 2．在陸地棉誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中NH<,4>NO<,3>的水平對愈傷組織以后能否發(fā)生體細(xì)胞胚胎分化至關(guān)重要，在分化培養(yǎng)基中撤去NH<,4>NO<,3>，并增加KNO<,3>，可以明顯提高愈傷組織胚分化率，使珂字201、YZl的愈傷組織胚分化

4、率達(dá)到80％以上。鐵鹽對愈傷組織誘導(dǎo)和胚分化起著十分重要的作用。當(dāng)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不含鐵鹽時(shí)，不同基因型的外植體均未見膨大，更沒有誘導(dǎo)出愈傷組織。硫酸亞鐵的濃度以56 mg/L為佳，此時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)95-100％，將愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上時(shí)，添加硫酸亞鐵的濃度為28 mg/L、56 mg/L時(shí)，不同基因型的愈傷組織生長都比較迅速，胚分化的時(shí)間縮短。 3．利用IBA和KT激素組合，結(jié)合不同階段的無機(jī)鹽調(diào)控，使供試的22個(gè)

5、陸地棉品種中有15個(gè)品種實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞胚胎分化和植株再生，其中鄂抗棉3號、5號、鄂棉20、23號、豫棉9號、豫早73、豫棉12號、豫棉1221等8個(gè)品種是首次獲得體細(xì)胞胚胎發(fā)生的品種。考察以上8個(gè)品種的系譜發(fā)現(xiàn)，鄂抗棉3、5號主要含有岱字棉15號的血統(tǒng)，鄂棉20含有金字棉的血統(tǒng)，豫棉9、12號則含有福字棉的血統(tǒng)，豫早73含有烏干達(dá)棉的血統(tǒng)，其他的材料遺傳背景比較復(fù)雜。許多研究表明，珂字棉的再生能力最強(qiáng)，岱字棉較易再生，而含有金字棉、福字棉、

6、烏干達(dá)棉血統(tǒng)的品種則較難獲得體細(xì)胞胚和再生植株。本試驗(yàn)中，首次實(shí)現(xiàn)了5個(gè)含有金字棉、福字棉、烏干達(dá)棉血統(tǒng)的品種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生。比較長江和黃河流域棉區(qū)棉花品種的胚胎發(fā)生和植株再生能力發(fā)現(xiàn)，長江流域的10個(gè)品種再生6個(gè)(分別是鄂抗棉3、5號、鄂抗棉9號、鄂荊1號、鄂棉20、23號)、黃河流域的10個(gè)品種再生7個(gè)(分別是中棉27號、晉棉18、20號、豫棉9、12號、豫早73和豫棉1221)，表明長江和黃河流域棉區(qū)品種的胚胎發(fā)生和植

7、株再生潛力沒有明顯差別，這與以往研究結(jié)果棉花體細(xì)胞胚胎發(fā)生有嚴(yán)格地域性限制有所不同。但兩大棉區(qū)品種體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生時(shí)間有明顯差異，長江流域棉區(qū)的品種分化時(shí)間平均比黃河流域的品種晚近20d。 4．研究發(fā)現(xiàn)海島棉愈傷組織誘導(dǎo)困難、出愈時(shí)間長，與相同誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)陸地棉品種相比，出愈時(shí)間延遲10-15天，出愈率偏低，主要原因是海島棉外植體易褐化導(dǎo)致生長緩慢，且所有供試海島棉品種剛開始誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地均為硬塊狀且增殖緩慢，由這

8、種硬塊狀愈傷組織進(jìn)一步誘導(dǎo)、繼代，形成質(zhì)地疏松的愈傷組織需要一個(gè)漫長的過程。最長達(dá)236天，這也是海島棉品種難以進(jìn)行組織培養(yǎng)的主要原因之一。 5．2,4-D的加入對海島棉愈傷組織誘導(dǎo)和胚分化有顯著影響，加入2,4-D不僅能提高出愈率、縮短出愈時(shí)間，而且還能使獲得質(zhì)地疏松愈傷組織的時(shí)間大大提前，平均提前達(dá)40天以上。在海島棉愈傷組織誘導(dǎo)階段，最佳激素配比為0.2 mg/L 2,4-D+0.4mg/L KT+1.0 mg/L IBA

9、，而在愈傷組織分化階段以0.05 mg/L 2,4-D+0.2 mg/LKT+0.5 mg/L BA為最好。懸浮培養(yǎng)有利于海島棉愈傷組織分化，與相同的固體培養(yǎng)相比，愈傷組織分化率平均提高5％以上，分化時(shí)間提前20天以上，但利用懸浮培養(yǎng)未能使在固體培養(yǎng)條件下沒有發(fā)生胚分化的海島棉基因型產(chǎn)生胚分化。 6．對遺傳轉(zhuǎn)化的影響因子優(yōu)化研究表明，以預(yù)培養(yǎng)12天的棉花胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，用OD<,600>值為0.4．的農(nóng)桿菌菌液侵染，加入

10、50mg/L的乙酰丁香酮(AS)活化，能夠使YZ1、珂字201的抗性愈傷率分別達(dá)25.1％和23.8％。 7．利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)棉花胚性愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體的遺傳轉(zhuǎn)化體系，將ipt基因?qū)氲紺oker 201、YZ1、Ym4和Em23棉花品種中，獲得的再生植株經(jīng)卡那霉素涂抹、PCR擴(kuò)增、Southern雜交檢驗(yàn)，證明ipt基因已整合到部分再生的棉花植株的基因組中。通過對再生植株田間初步觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出生長旺盛、果枝數(shù)增多、葉

11、功能期延長等特征。 8．研究了不同基因型的遺傳轉(zhuǎn)化效率并建立了轉(zhuǎn)基因再生植株的有效成苗技術(shù)體系。結(jié)果表明：在相同的轉(zhuǎn)化條件下，不同基因型的轉(zhuǎn)化效率差異較大，豫早1號和珂字201的遺傳轉(zhuǎn)化效率及植株再生能力顯著高于豫棉4號和鄂棉23。降低培養(yǎng)基無機(jī)鹽濃度，用Phytagel固化，能夠提高胚萌發(fā)成苗率，降低畸形苗頻率，在生根培養(yǎng)中添加少量活性碳提高了根系活力。再生植株長到3～5片真葉時(shí)，出現(xiàn)的植株根系發(fā)褐，可以切除，轉(zhuǎn)移到新鮮的低鹽