小麥細(xì)胞操作與基因工程體研究.pdf

1、小麥（TriticumaestivumL.）是世界上第一大糧食作物，是我國(guó)僅次于水稻的第二大糧食作物，其籽粒中含有65-70﹪的淀粉、7-22﹪的蛋白質(zhì)、2-4﹪的脂肪，同時(shí)還有鉀、磷、鎂、鐵、氟等多種礦質(zhì)元素和維生素B。因此對(duì)小麥的育種研究，特別是以基因工程為重點(diǎn)的品質(zhì)改良研究，一直是基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用研究中最重要的課題之一。本文應(yīng)用現(xiàn)代組織培養(yǎng)技術(shù)和現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)6個(gè)小麥主栽品種的組織培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究；對(duì)100個(gè)株系的1

2、Dx5基因轉(zhuǎn)基因小麥的后代遺傳特性及表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)分析。研究工作的主要內(nèi)容和結(jié)論如下。 1.優(yōu)化了小麥組織培養(yǎng)條件，建立了以小麥幼穗切段、幼胚盾片和成熟胚盾片為外植體的高效穩(wěn)定再生體系。①基因型：對(duì)6個(gè)基因型的共4430個(gè)材料個(gè)體的組織培養(yǎng)結(jié)果表明，總體植株平均再生頻率為17.2﹪，鄂麥12的再生頻率要顯著高于其它品種，平均為22.0﹪，單個(gè)組合中最高平均可以達(dá)到83﹪；②外植體：幼穗、幼胚和成熟胚的平均植株再生頻率分別為2

3、9.6﹪、30.1﹪和5.0﹪，優(yōu)化后分別為46.7﹪、63.3﹪和13.3﹪，單個(gè)組合中最高分別可達(dá)60.0﹪、83.0﹪和30.0﹪，各組培外植體植株再生能力順序?yàn)椋河着摺萦姿?成熟胚。③激素：2,4-D與Picloram誘導(dǎo)愈傷組織的總體植株再生頻率分別為27.6﹪和18.2﹪；分化培養(yǎng)基中含0.01mg/l和0.1mg/l2,4-D的植株總體再生頻率分別為23.5﹪和11.9﹪；幼穗、幼胚和成熟胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別含4.5mg/l

4、2,4-D、0.5mg/l2,4-D和1mg/lPicloram，分化培養(yǎng)基中均含0.01mg/l2,4-D為優(yōu)化后的激素條件；④繼代：愈傷組織繼代對(duì)植株的再生頻率沒有顯著的影響；⑤洗滌劑：稀釋到10.0﹪的家用白貓洗潔精（GB9985）和升汞消毒處理后的植株總體再生頻率分別為22.1﹪和25.8﹪，組織培養(yǎng)的污染率分別僅為8.3﹪和0.0﹪；⑥再生分化指標(biāo)間的相關(guān)分析表明：綠點(diǎn)分化和每團(tuán)愈傷組織出苗數(shù)相互獨(dú)立；根的分化與植株再生存在顯

5、著負(fù)相關(guān)，但與綠點(diǎn)分化具極顯著正相關(guān)；每團(tuán)愈傷組織出苗數(shù)與植株再生具極顯著正相關(guān)； 2.分析了外源1Dx5基因的表達(dá)規(guī)律。①轉(zhuǎn)基因材料的栽培試驗(yàn)：對(duì)140個(gè)單株的栽培實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了溫度和水分對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響；以y、x1、x2、x3和x4分別表示穗長(zhǎng)、株高、節(jié)數(shù)、頂節(jié)長(zhǎng)和劍葉長(zhǎng)，分析得到y(tǒng)=1.413+0.050x1+0.149x2-0.867x3-0.024x4生長(zhǎng)特征方程式；溫室中各個(gè)基因型的植株成活率、分蘗數(shù)、株高、節(jié)數(shù)、頂節(jié)長(zhǎng)

6、、穗長(zhǎng)、劍葉長(zhǎng)和種子數(shù)的總體平均都大于網(wǎng)室中生長(zhǎng)結(jié)果；②葉片DNA提取方法的優(yōu)化：對(duì)117個(gè)單株的DNA提取量平均為116ng，最高為250ng；選取7cm長(zhǎng)三葉期幼嫩葉片，DNA提取過程中溫浴30分鐘、離心7分鐘為優(yōu)化的條件；③PCR和SDS-PAGE分析：對(duì)102個(gè)樣品材料的PCR結(jié)果是對(duì)照都沒有1Dx5基因片段的存在，轉(zhuǎn)基因株系48個(gè)B72-8-11b的單株中有26個(gè)有1Dx5基因，B73-6-1的52個(gè)單株全部檢測(cè)到1Dx5基因