PCR檢測(cè)仔豬黃痢及多價(jià)菌毛油乳劑疫苗免疫原性研究.pdf

1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文PCR檢測(cè)仔豬黃痢及多價(jià)菌毛油乳劑疫苗免疫原性研究姓名：李鵬申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：戴鼎震;陳煥春2002.5.1A b s t r a c tE s c h e r i c h i a c o i l a s s o c i a t e d n e w b o r n p i g l e t s d i a r r h e a i s m a i n l y e n t e r o t o

2、x i g e a i cE s c h e r i c h i ac o l i ( E T E C ) ，E T E Cu s u a l l ya d h e r e sa n dp r o l i f e r a t e si ns m a l li n t e s t i n ee p i t h e l i a lc e l l sa n d s e c r e t e st o x i n st oc a u s e p

3、i g l e t s d i a r r h e ha n d m o s t w a t e r a n de l e c t r o l y t el o s t ，a n da sar e s u l t ，t h ep i g l e t sf a i l e di n t ow e a k a n de v e nd e a t h ，a n dp i gf r a m si n c u r e dg r e a tl o

4、s s e s ．S oa ni m p o r t a n t t a s kw h i c h w e w e r e f a c e d w i t hw a s t ot a k ee f f e c t i v em e a s u r e s t od e t e c ta n d p r e v e n tt h i sd s e a s e T h i sa r t i c l ed e a l e dw i t ht

5、h ed e t e c t i o no f p i l l a n dr e s e a r c ho ni m m u r o g e n i c i t yo fm u l t i v a l e n tp i l l o i l - e m u l s i o nv a c c i n e ．F i r s t l y , t h em a i nt o x i np i l l f a c t o r so fE T E C

6、 K 8 8a n dK 9 9 w e r e d e t e c t e db y p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( P C R ) ．T h ep r i m e r s f o rP C R o f K 8 8 a n d K 9 9p i l i p r o t e i ns t r u c t u r a lg e n e sw e r ed e s i g n e

7、 dw i t hG o l d k e yc o m p u t e rs o f tw a r e ．A f t e rP C R ，l 7s u s p e c t e dK 8 8p i l l p r o t e i n s t r u c t u r a l g e n e sa m p l i f i c a t i o np r o d u c tw e r eo b t a i n e df r o mt h ep l

8、 a s m i d so f 2 0w i l di s o l a t e ds t r a i n s ．A n d8p o s i t i v ep r o d u c t sw e r es e l e c t e da n dc l o n e da n dl i g a t e da n dt r a n s f o r m e da n ds e q u e n c e da n da n a l y s e d ．T

9、h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e i rp r o t e i ns t r u c t u r a lg e n es e q u e n c e sw e r ei na u o r d a n c ew i t ht h er e p o r t so v e r s e a ．A m o n gt h e s es t r a i n s ，t h en u m b e ro fK

10、8 8 a b ，K 8 8 a d ，K 8 8 a cw e r e3 ，4 a n d1 ．A c c o r d i n g l y , 1 2 s u s p e c t e dp o s t i v ep r o d u c t sw e r eo b t a i n e db yP C R f r o m2 0w i l di s o l a t e ds t r a i n sa n d w e r eb l o th

11、y b r i d i z e dw i t ht h eK 9 9 p r o t e i ng e n ep r o b el a b e l l e db yD I G ．T h ew i l ds t r u c t u r eg e n e so f p i l l p r o t e i nw e r ev e r i f i e dt h a tt h e yw e r e K 9 9 g e n e s ．S e c o

12、 n d l y ，t h ec o n d i t i o n so f P C R f o ra m p l i f y i n g p i l ip r o t e i ng e n e sw e r eo p t i m i z e d ，a n dK 8 8 - K 9 9 P C R d i a g n o s i sk i t sw e r ei n v e n t e d ．I nt h e5 0 u lo p t i

13、m a lr e a c t i o ns y s t e m ，t h et e m p l a t ea n d T a qe n z y m e a n dd N T P s ，M g ”w e r e10 0 C F U ，5 U ，2 0 0 um o l ／La n d2 m m o l ／Lr e s p e c t i v e l y 2 3 8p i e c e so f p i g sf a e c e sf r o

14、 m5d i f f e r e n tf a r m si n H u b e ia n d J i a n g s u p r o v i e n c e s w e r e d e t e c t e d w i t h t h e K 8 8 一K 9 9 d i a g n o s i s k i t s ．a(chǎn) n d 9 2O ％( 2 1 9 ／2 3 8 ) o fK 8 8a n d8 9 ．1 ％( 2 1 2 ／2

15、 3 8 ) 0 fK 9 9o fs a m p l e sw e r ed e t e c t e d i n d i v i d u a l l y ．T h ep o s i t i v e c o n t r a s t sc o u l db e a m p l i f i e dw e r e 10 0 ％，w h i l et h en e g a t i v e c o n t r a s th a dn o t h

16、i n gT h i s e x p e r i m e n t s a l s o s h o w e dt h a t t h e P C R d i a g n o s i s k i t s c o u l d d e a l w i t h m u c hm o r es a m p l e sf a s t ，s e n s i t i v e l ya n d c o n v i e n t l y a tt h es a

17、 m e t i m e ，a n di tc o u l d e x a m i n e sf a e c e sa m p l e sd i r e c t l y ．T h i r d l y ，a c c o r d i n gt ot h es u r v e yr e s u l t so f c l i n i cd i a g n o s i sw i t ht h i sk i t ，5b a t c h e so f

18、m u l t i v a l e n tp i l i o i l ·e m u l s i o nv a c c i n ew e r ep r o d u c e d ．T h eb a c t e r i as t r a i n s f o rv a c c i n ew e r ef r o mw i l di s o l a t e ds t r a i n st h a tc o u l dp r o d u

19、c ef i m b r i aa d h e r s i n s ．T h e s es t r a i n sw e r en a m e d a sH N 2 0 0 1 ( K 8 8 a b ) ，H N 2 0 0 2 ( K 8 8 a c ) ，H N 2 0 0 3 ( K 8 8 a d ) ，H N 2 0 0 4 ( K 9 9 ) ．T h e s t a n d a r ds t r a i n sC 8 3

20、 9 1 5 ( 9 8 7 p ) a n dC 8 3 6 2 1 ( F 4 1 ) w e r ea l s ou s e d ．P r o t e c t i o ne x p e r i m e n t so nm i c e ss h o w e dt h a t9 5 ％( 3 8 ／4 0 ) o f m i c e sw e r ep r o t e c t e d ．T h et i t e ro f A n t