馬氏珠母貝血清抗菌活性蛋白的分離純化與鑒定.pdf

1、馬氏珠母貝（Pinctada martensii）是我國人工海水育珠的主要珍珠貝之一，近年來因沿海水質(zhì)的日趨惡化，各種病害也頻繁發(fā)生，導致馬氏珠母貝因病害發(fā)生大量死亡，對我國珍珠產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此，了解馬氏珠母貝免疫機制并在此基礎(chǔ)上提高馬氏珠母貝抗脅迫能力是目前亟需解決的問題?？咕氖秦愵惿锩庖邫C制中最重要的一個環(huán)節(jié)，但目前對馬氏珠母貝抗菌肽的報道甚少。本實驗采用多步高效液相色譜結(jié)合質(zhì)譜分析，對馬氏珠母貝血清中具有抑菌活性

2、的蛋白質(zhì)開展了分離純化及鑒定研究，從中獲得三種具有抑菌活性的蛋白質(zhì)成分，分別將這三種抗菌活性蛋白命名為PmECSOD(馬氏珠母貝超氧化物歧化酶，P.martensii extracellular superoxidedismutase)，PmCLEC-1(馬氏珠母貝C-型凝集素，P.martensii c-type lectin)，PmAMP-1（馬氏珠母貝抗菌肽，P.martensii antimicrobial peptide-1）

3、。為了進一步了解這三種活性蛋白的基因組成，通過在馬氏珠母貝的基因組和NCBI提供的珠母貝數(shù)據(jù)庫中搜索同源核酸序列并以之為模板設計引物，運用cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)，成功克隆得到這三種蛋白質(zhì)的cDNA全序列，運用實時熒光定量PCR進一步研究了三者的組織特異性分布以及細菌誘導后基因豐度變化情況。結(jié)果如下:
　　1、馬氏珠母貝超氧化物歧化酶(PmECSOD)基因cDNA全長序列為1864 bp，開放閱讀框(ORF)為1422

4、bp，編碼473個氨基酸，N-末端有信號肽，有20個氨基酸，成熟肽有453個氨基酸。氨基酸序列分析顯示，PmCESOD的氨基酸序列具有典型的SOD結(jié)構(gòu)域，在它的N端還有FRI和IGc2兩個結(jié)構(gòu)域。同源性分析顯示PmECSOD與其它兩種貝類的ECSOD相似性很低，與海灣扇貝太平洋長牡蠣的相似度是分別是36.42％和28.32％。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，該基因在閉殼肌、外套膜、肝胰腺、鰓、性腺以及血淋巴六個組織中均有表達，在鰓中的表達量最高，在閉

5、殼肌中的表達量最低。經(jīng)過誘導刺激之后，48h在血淋巴中表達含量達到最高，具有顯著性差異。
　　2、馬氏珠母貝C-型凝集素(PmCLEC-1)基因cDNA全長序列為636bp，開放閱讀框（ORF）為450bp，編碼149個氨基酸，其中有19個信號肽，成熟肽為130個氨基酸，具有C-型凝集素典型的結(jié)構(gòu)域——糖結(jié)合識別位點(CDR)。與馬氏珠母貝其他兩種的C-型凝集素PoLEC-1和PoLEC-2對比，發(fā)現(xiàn)與兩者的相似度很低?？臻g結(jié)構(gòu)顯

6、示PmCLEC-1除了有緊湊結(jié)構(gòu)，在N端還有兩個Cys。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，在外套膜和肝胰腺的含量最高，而血淋巴中的含量最低。細菌誘導之后，12h在血淋巴中的表達含量最高。
　　3、馬氏珠母貝抗菌肽(PmAMP-1)基因cDNA全長為700bp，其中開放閱讀框為306bp，編碼了101個AA。空間結(jié)構(gòu)顯示PmAMP-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)。通過電鏡進一步觀察了PmAMP-1對細菌的作用機制。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，在閉殼肌中表達含量最高，血淋巴