馬氏珠母貝植核育珠移植耐受免疫相關(guān)基因與蛋白質(zhì)鑒定及分析.pdf

1、馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)是我國(guó)重要的人工海水育珠貝。海水珍珠培育的最核心環(huán)節(jié)是植核育珠技術(shù):即將珠核和細(xì)胞小片（來(lái)源于供體貝）移植到受體貝的內(nèi)臟團(tuán)，受體貝組織和細(xì)胞小片共同形成珍珠囊，分泌珍珠質(zhì)形成珍珠。植入的珠核和細(xì)胞小片在受體貝體內(nèi)會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，可能會(huì)導(dǎo)致受體貝排出植入的珠核，甚至死亡。因此，長(zhǎng)期以來(lái)，科研人員及養(yǎng)殖者都積極采取各種措施以試圖降低植核育珠中的免疫排斥反應(yīng)，但到目前為止，未

2、能解決此類問(wèn)題，其根本原因是機(jī)體針對(duì)植核育珠應(yīng)激的免疫應(yīng)答關(guān)鍵因子尚未明了。
　　本研究以馬氏珠母貝為研究對(duì)象，通過(guò)植核育珠手術(shù)培育珍珠，以植核后不同時(shí)期馬氏珠母貝血淋巴細(xì)胞為研究材料，通過(guò)RNA高通量測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序、組裝和生物信息學(xué)分析，分析免疫相關(guān)基因的差異表達(dá)并篩選關(guān)鍵信號(hào)通路，確定參與此過(guò)程的差異表達(dá)基因;同時(shí)運(yùn)用同位素相對(duì)與絕對(duì)定量(iTRAQ)技術(shù)與液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS

3、/MS)技術(shù)聯(lián)用，對(duì)植核后不同時(shí)期的血細(xì)胞總蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量分析，篩選植核育珠過(guò)程中的免疫相關(guān)蛋白質(zhì)。結(jié)果如下:
　　利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到植核育珠過(guò)程中7個(gè)不同時(shí)期的血細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，合并為1個(gè)轉(zhuǎn)錄組文本集，共得到81，390個(gè)unigene，預(yù)測(cè)到的CDS共有36，604個(gè)。注釋到NR、Swiss-Prot、COG和GO庫(kù)的unigene分別有31，689個(gè)、25，253個(gè)、12,065個(gè)和12,720個(gè)。其中COG分類中有1，6

4、36個(gè)unigene的功能是未知的。大約有21，811個(gè)unigene可能參與302個(gè)已知的代謝通路。與植核前相比，植核育珠后5天、10天、15天、20天、30天和60天分別有3，345、6，846、4，636、4，167、4，716和6，679個(gè)差異表達(dá)基因，且在植核育珠后第10天差異表達(dá)基因數(shù)目最多。從植核育珠后不同時(shí)期差異表達(dá)基因中篩選出的46個(gè)免疫相關(guān)基因，分別編碼溶菌酶、清道夫受體、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、甘露糖受

5、體、凝集素和Toll樣受體等蛋白。在不同時(shí)期的差異表達(dá)基因的KEGG富集結(jié)果中都發(fā)現(xiàn)細(xì)胞粘附分子(cell adhesionmolecules)通路和原發(fā)性免疫缺陷(primary immunodeficiencies)通路被顯著性富集(P＜0.05)。
　　利用iTRAQ技術(shù)并結(jié)合LC-MS/MS，對(duì)馬氏珠母貝植核前、植核育珠后10天、20天和30天的血細(xì)胞總蛋白質(zhì)進(jìn)行了相對(duì)與絕對(duì)定量分析，共采集到277，226張二級(jí)質(zhì)譜圖，鑒

6、定到的肽段數(shù)目為43，421條，獲得的蛋白質(zhì)有2，702個(gè)。與植核前相比，植核育珠后10天、20天和30天的血細(xì)胞中分別有97、103和101種顯著差異蛋白。10天與植核前相比，有37個(gè)上調(diào)蛋白、60個(gè)下調(diào)蛋白;20天與10天相比，得到29個(gè)差異蛋白，其中21個(gè)上調(diào)，8個(gè)下調(diào);30天與20天相比，有12個(gè)上調(diào)差異蛋白、9個(gè)下調(diào)差異蛋白。獲得的免疫相關(guān)的差異蛋白質(zhì)有原鈣黏蛋白(Protocadherin)、血纖維蛋白溶酶原(Plasmin

7、ogen)、細(xì)胞凋亡蛋白酶(caspase)、干擾素誘導(dǎo)蛋白、白介素17受體、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子相關(guān)因子、熱休克蛋白70、TRIM家族蛋白、TNF-α誘導(dǎo)蛋白、Notch家族蛋白、抗菌L-氨基酸氧化酶、E3泛素連接酶、整合素、死亡相關(guān)蛋白激酶、肽聚糖識(shí)別蛋白等。
　　本研究分別從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組兩個(gè)方面研究了馬氏珠母貝植核育珠后不同時(shí)期血淋巴中與免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)，不僅豐富了馬氏珠母貝的cDNA和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，而