馬氏珠母貝富硒蛋白的生物構建及抗氧化活性初探.pdf

1、馬氏珠母貝(Pinctada martensii)肉作為我國南方海水珍珠生產(chǎn)過程中的的副產(chǎn)品，除直接鮮食外一般作為飼料或棄于周邊，利用率低，既浪費資源又污染環(huán)境。隨著人們對硒及其生物功能研究的逐步深入，有機硒作為安全有效的硒源已受到廣泛的關注，并有研究表明水生生物的硒蛋白組比陸生生物大，因此硒蛋白種類較為豐富，是很好的有機硒源。目前水生生物富硒產(chǎn)品多以藻類為主，但藻類的生物量小，限制了富硒產(chǎn)品的開發(fā)及利用，而關于馬氏珠母貝的富硒及食物鏈

2、富硒的方法尚未見報道。本文以扁藻和馬氏珠母貝為原料，探討了食物鏈富硒的可能性，構建了通過食物鏈培育富硒馬氏珠母貝的生物流程，并對富硒馬氏珠母貝硒蛋白進行分離純化，以了解硒在馬氏珠母貝不同蛋白組分內的分布，通過建立乳鼠心肌細胞的H2O2氧化模型，初步探討了馬氏珠母貝含硒蛋白的抗氧化活性，以期為馬氏珠母貝硒蛋白的進一步分離純化和利用提供依據(jù)和基礎。
　　本文的主要研究內容與結果如下：
　　1.以不同濃度的硒處理扁藻培養(yǎng)基，分別采

3、用紫外分光光度計、氫化物原子熒光光譜法、凱氏定氮法以及考馬斯亮藍法測定扁藻的生物量、藻粉中硒含量、藻粉中的蛋白質含量和扁藻粗蛋白的蛋白質含量，從而觀察不同硒濃度對扁藻生長情況和扁藻富硒能力的影響。結果表明，硒對扁藻生長的96h-EC50為33.65mg/L，硒對扁藻生長的促進濃度范圍為4.8~10.4mg/L，22.9mg/L以上硒濃度則會抑制甚至完全抑制扁藻的生長；扁藻的富硒能力與培養(yǎng)液初始硒濃度呈正相關，硒濃度大于10.4mg/L時

4、，扁藻硒含量明顯增高，為普通扁藻的110~187倍，其中5.56％的硒與蛋白質相結合存在，綜合考慮所得扁藻的生物量及硒含量，確定富硒扁藻的最佳處理條件為：初始硒濃度10.4mg/L，培養(yǎng)時長為7d。
　　2.以所得的富硒扁藻投喂馬氏珠母貝，采用氫化物原子熒光光譜法、凱氏定氮法、和考馬斯亮藍法分別測定馬氏珠母貝肉及不同部位的硒含量、馬氏珠母貝肉的蛋白質含量和粗蛋白中的蛋白質含量，以檢測不同投喂時間對馬氏珠母貝富硒能力的影響。結果表明

5、，富硒馬氏珠母貝的最佳培養(yǎng)條件為：富硒藻粉投喂量1g/L，培養(yǎng)時長為10d；硒在馬氏珠母貝的內臟團、外套膜和壁殼肌中均有分布，且含量依次降低；馬氏珠母貝中的蛋白結合硒占總硒的14.00%，為扁藻的2.5倍，說明通過食物鏈傳遞，硒與蛋白的結合率有了明顯的提高。
　　3.用 Tris-HCl緩沖液對富硒馬氏珠母貝蛋白進行提取，并通過等電點測定、(NH4)2SO4分步鹽析、Sephadex G-75柱層析及SDS-PAGE電泳分析對硒蛋

6、白進行初步分離純化，以探討硒在不同蛋白組分內的分布和主要硒蛋白的分子量范圍。結果表明，富硒馬氏珠母貝堿溶性蛋白的等電點初步確定處于pH3.9左右。B組蛋白，即40%(NH4)2SO4飽和度下的蛋白組分中硒含量最高，為77.69mg/kg pro；其次是20%和100%飽和度下的蛋白組分，硒含量分別為71.64mg/kg pro和70.98mg/kg pro；B組蛋白經(jīng)Sephadex G-75柱進行分離后共出現(xiàn)3個蛋白峰，峰2的硒蛋白含

7、量最高，為554.35mg/kg pro；峰2中蛋白的分子量大約分布在200、97、44及35kD左右。
　　4.試驗通過構建乳鼠心肌細胞H2O2氧化損傷模型，對心肌細胞MDA含量、SOD活性和GSH-Px活性進行檢測，從而觀察富硒馬氏珠母貝含硒蛋白對心肌細胞的保護作用，結果表明，富硒馬氏珠母貝含硒蛋白可以降低 H2O2誘導氧化損傷心肌細胞的MDA含量，抑制心肌細胞SOD和GSH-Px活性的下降，從而起到對H2O2誘導的氧化損傷的