高粱SbGABA-Ts基因的克隆、功能研究及其遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、生態(tài)環(huán)境惡化嚴(yán)重影響作物生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量。作為糧飼能兼用的世界第五大農(nóng)作物，高粱具有生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量高、抗逆性突出等諸多優(yōu)點(diǎn)，其種質(zhì)的創(chuàng)新與性狀改良對(duì)于解決耕地、人口、資源、能源與環(huán)境之間矛盾有重要意義。γ-氨基丁酸（GABA）途徑代謝旁路途徑位于TCA循環(huán)的一個(gè)支路，已有研究表明，該途徑與呼吸作用、激素合成、多胺代謝、活性氧生成、信號(hào)傳遞等生理過(guò)程聯(lián)系緊密，參與植株的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫應(yīng)答調(diào)控。高粱中GABA途徑的研究尚屬空白。
　　本

2、研究首次從高粱中分離了與GABA代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶（GABA-T）基因，并對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析、原核表達(dá)和酶活分析、組織發(fā)育和脅迫應(yīng)答表達(dá)模式分析，同時(shí)對(duì)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高粱幼胚遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了研究，主要結(jié)果如下：
　　1.利用同源序列比對(duì)和RT-PCR技術(shù)首次從高粱中分離鑒定出SbGABA-Ts基因，該基因存在兩個(gè)亞型（登錄號(hào)分別為：XM_002445162、XM_002-447046），其氨基酸序列相似性為

3、78.8％；保守結(jié)構(gòu)域分析表明，這兩個(gè)基因均隸屬于乙酰鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AAT_Ⅰ）超家族；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析顯示SbGABA-Ts歸屬于單子葉植物分支，與水稻GABA-T基因親緣關(guān)系較近。
　　2.通過(guò)SbGABA-Ts的N端信號(hào)肽序列與GFP融合表達(dá)，利用煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，激光共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察可知，SbGABA-Ts均定位于線粒體中，表明SbGABA-Ts主要在線粒體中行使功能。這與SbGABA-Ts

4、亞細(xì)胞定位的在線程序預(yù)測(cè)結(jié)果一致。
　　3.去除信號(hào)肽的SbGABA-Ts基因的編碼區(qū)序列，能通過(guò)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)，重組蛋白經(jīng)過(guò)純化和蛋白酶活性測(cè)定，結(jié)果表明SbGABA-Ts蛋白具有γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性，并能以丙酮酸和乙醛酸為氨基酸受體，而未檢測(cè)出α-酮戊二酸代謝活性。
　　4.通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)高粱SbGABA-Ts基因的組織發(fā)育表達(dá)模式，結(jié)果表明，SbGABA-Ts在高粱各組織器官的不同發(fā)育階段均

5、有表達(dá)，豐度隨組織發(fā)育有所變化；持續(xù)高鹽脅迫下高粱幼苗 SbGABA-Ts基因的表達(dá)模式表明， SbGABA-Ts的表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)，其豐度的增加一定程度上與積累的GABA含量相適應(yīng)，表明SbGABA-Ts可能通過(guò)促進(jìn)GABA的分解代謝參與植物的逆境脅迫響應(yīng)。脅迫下高粱葉片中SbGABA-Ts的表達(dá)具有明顯的晝夜節(jié)律性。
　　5.利用高粱幼胚為受體材料，探究高粱基因型對(duì)組培過(guò)程的影響，結(jié)果表明，基因型在愈傷組織誘導(dǎo)、增殖和分化過(guò)程