AUX-IAA、HO、LBD基因在“川北柴1號”側(cè)根形成過程中的表達分析.pdf

1、柴胡（Radix Bupleuri）是多年生草本植物，其根為常用作大宗藥材之一。柴胡有效成分為三萜皂苷和揮發(fā)油，其中，柴胡皂苷具有抗?jié)儭⒈８?、解熱、?zhèn)咳、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗病原體、抗炎、抗腫瘤等多方面的藥理作用。柴胡具有獨立的根系構(gòu)型，北柴胡有多支根型、少支根型和單根型分離現(xiàn)象；狹葉柴胡有棕色根和白色根的分離。對這些分離出來的新品系分析發(fā)現(xiàn)，不同根系構(gòu)型柴胡品系間藥效成分差異顯著。本研究利用北柴胡（Bupleurum chineses D

2、C）新品種川北柴1號克隆了柴胡側(cè)根形成相關(guān)基因，并分析了這些基因在側(cè)根形成前后及組織器官表達特異性。初步篩選出川北柴1號側(cè)根形成過程中的相關(guān)基因，為進一步確定影響柴胡側(cè)根形成的關(guān)鍵基因，及其功能驗證工作奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
　　1.實時熒光定量PCR篩選“川北柴1號”內(nèi)參基因
　　利用實時熒光定量PCR分析了18個候選內(nèi)參基因在川北柴1號不同生育期和不同器官中的表達穩(wěn)定性。所有候選內(nèi)參基因的Ct值相對寬泛。3種不同算法（

3、Bestkeeper,NormFinder和GeNorm）的軟件對參試內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析結(jié)果表明：ADF1b、ADF5、ADF7、eIF2b和ACT2為最為合適的內(nèi)參基因，而eIF6被認為穩(wěn)定性最差的內(nèi)參基因。穩(wěn)定的內(nèi)參基因為進一步分析北柴胡目標(biāo)基因的表達特征奠定了重要基礎(chǔ)。
　　2.AUX/IAA、HO、LBD等基因的克隆及測序分析
　　在川北柴1號中克隆了包括生長素響應(yīng)基因（auxin-responsive,AUX/I

4、AA）、血紅素加氧酶基因（heme oxygenase,HO）、側(cè)生結(jié)構(gòu)相關(guān)基因（Lateral organ Boundaries-Domain LBD)、乙烯合成基因（1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase,ACO)及No Apical Meristem-Arabidopsis thaliana-1- cup-shaped cotyledon（NAC)的23個影響側(cè)根形成的相關(guān)基因。除4個A

5、UX/IAA基因未克隆成功外，其余19個基因與原始序列相似度均在96％以上。
　　3.AUX/IAA、HO、LBD等基因在“川北柴1號”側(cè)根形成過程中的表達分析
　　利用時實時熒光定量PCR分析19個候選功能基因在川北柴1號側(cè)根形成過程中的表達情況。其中LBD16-CH-c13144基因在川北柴1號根中的表達明顯高于葉片，且在側(cè)根形成前的根（WG）中表達量最高，是已長側(cè)根的主根（YG）中表達量的5倍。IAA9-CH-c657

6、0、IAA1在根中的表達量高于葉，而隨著生長時間的延長，該基因在根中的表達量有所下降；IAA11-CH-c3456在根中的相對表達量隨著生長時間的延長有所下降，和HO-CH-c4076兩個基因一樣，在WG中的表達量均明顯高于YG，ACO1基因總體表現(xiàn)出極高的相對表達量，該基因在葉中表達量高于根，盡管如此，在根中的表達量隨著時間的延長呈現(xiàn)出明顯（近幾百倍）的下降趨勢。因此，初步確定這6個基因參與了川北柴1號側(cè)根發(fā)育過程。
　　4．目

7、的基因的生物信息學(xué)分析
　　對初步篩選出的LBD16-CH-c13144、IAA9-CH-c6570、IAA1、IAA11-CH-c3456、HO-CH-c4076、ACO1等6個基因進行了包括氨基酸序列同源性分析、蛋白組分分析、氨基酸跨膜區(qū)及親水性預(yù)測、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和蛋白質(zhì)亞細胞定位在內(nèi)的生物學(xué)特性分析。結(jié)果表明，LBD16-CH-c13144、IAA、ACO1三個基因為疏水蛋白，且所有氨基酸均沒有跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于跨膜蛋白

8、。對它們編碼的蛋白質(zhì)進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，所有蛋白無規(guī)則卷曲（Coil，c）含量最高。亞細胞定位結(jié)果表明LBD16-CH-c13144蛋白主要存在于細胞核中，IAA9-CH-c6570蛋白主要存在于葉綠體中，IAA1蛋白主要存在于線粒體中，IAA11-CH-c3456蛋白主要存在于葉綠體中，HO-CH-c4076蛋白主要存在于質(zhì)膜中，ACO1蛋白則主要存在于液泡。
　　綜上所述，本研究利用川北柴1號篩選出適宜目標(biāo)基因表達模式分析的內(nèi)參