羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)體系的構建及應用.pdf

1、為建立高效的羽衣甘藍游離小孢子培養(yǎng)體系，加快育種材料純化，以10個羽衣甘藍雜交種為試材，采用游離小孢子培養(yǎng)方法，研究了培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對胚狀體發(fā)生、發(fā)育和再生植株的影響，探討了小孢子植株倍性鑒定方法及加倍技術，對獲得的雙單倍體植株的園藝學性狀進行了鑒定，獲得了下列試驗結果。 1.不同基因型材料適宜取樣花蕾的大小有一定的差異。多數(shù)品種適宜取蕾長度為3.0～4.5mm；花瓣與花藥長度之比為4/5～7/6，選擇圓形小孢子占絕大多數(shù)的花

2、蕾進行游離小孢子培養(yǎng)較適合。 2.基因型是影響羽衣甘藍小孢子胚誘導的關鍵因素之一。在10個供試基因型材料中，有7個基因型的胚狀體誘導獲得成功。小孢子胚誘導率最高的品種“Y009”出胚率達0.88胚·蕾-1。 3.植物生長調(diào)節(jié)劑對小孢子胚發(fā)生及發(fā)育有一定影響。6-BA對誘導小孢子胚有促進作用，適宜濃度為0.2mg·L-1；NAA抑制小孢子胚狀體發(fā)生，但能促進其發(fā)育，提高正常胚比例；2,4-D對誘導胚狀體發(fā)生有較強的抑制作用

3、；6-BA和NAA協(xié)調(diào)作用能顯著提高胚狀體誘導率，有利于萌發(fā)胚和子葉形胚的發(fā)生，適宜的濃度比為1∶1或2∶1。 4.瓊脂糖和活性炭對小孢子胚發(fā)生和發(fā)育有促進作用，對難成胚基因型的作用效果尤為顯著，適宜添加量為每皿添加0.5g·L-1的瓊脂糖和10g·L-1的活性炭混合液100μL。5.花蕾4℃低溫預處理能提高小孢子胚誘導率。該影響在“Y009”上表現(xiàn)不顯著，但可以暫時保存材料而不降低培養(yǎng)效果。 6.游離小孢子33℃高溫預

4、處理，可以改變小孢子發(fā)育方向，使其由配子體發(fā)育途徑轉向孢子體發(fā)育途徑，并使小孢子維持較高的活細胞頻率，促進細胞分裂和胚狀體發(fā)生。處理時間以24h為宜。 7.盛花期花蕾樣品成胚率高，其次為初花期。末花期花蕾樣品進行游離小孢子培養(yǎng)未獲得胚狀體。 8.培養(yǎng)基最適的蔗糖濃度為13％。 9.小孢子胚成苗能力與胚狀體發(fā)育時期有關。萌發(fā)胚、子葉形胚的成苗率較高，分別為85.71％和56.25％；魚雷形胚成苗率為28.57％；心

5、形胚和球形胚成苗率僅為9.76％；畸形胚不能成苗。 10.胚狀體成苗培養(yǎng)以瓊脂含量為1.0％的MS培養(yǎng)基為宜。 11.活性炭對子葉形胚成苗無明顯作用，但有利于魚雷形胚成苗，適宜的活性炭添加量為100mg·L-1。 12.魚雷形胚有兩條成苗途徑：一是胚根伸長，子葉萌發(fā)，與子葉形胚狀體成苗相似；另一種是經(jīng)脫分化后，形成綠白致密的愈傷組織，再分化成幼苗。 13.不同品種的羽衣甘藍胚狀體直接成苗能力有一定差別?！?/p>

6、Y009”的成苗率最高，達59.52％。胚狀體10℃下低溫培養(yǎng)10d左右可以提高直接成苗率，可使成苗率提高到68.00％。 14.小孢子試管苗繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基以MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.1mg·L-1+3％蔗糖+0.8％瓊脂為宜，平均增殖系數(shù)為5.06。壯苗培養(yǎng)的培養(yǎng)基以MS+NAA0.1mg·L-1+3％蔗糖+0.8％瓊脂為宜；生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基以1/2MS+NAA0.1mg·L-1+3％蔗糖+0.8％瓊脂為宜，1

7、5d生根率可達100％，并且根系粗壯整齊；在溫度、濕度和光照條件比較適宜的情況下，小孢子植株的移栽成活率可達82.60％。 15.小孢子植株倍性鑒定可以采用染色體計數(shù)的直接鑒定法和比較器官、組織、氣孔和花粉粒大小的間接鑒定法。田間形態(tài)學鑒定與染色體數(shù)目觀察結果的一致性達到85％以上。 16.不同品種的小孢子植株群體中，單倍體、雙單倍體、高倍體和嵌合體所占比例不同；品種間小孢子植株的自然加倍率有顯著差異，從23.33％到3