中國鹵蟲甘油激酶基因(As--gk)在胚胎滯育解除過程中的表達模式分析.pdf

1、分類號：密級：學(xué)校代碼： 1 0 1 6 5學(xué) 號：2 0 1 1 1 1 1 5 5遣掌研耗大學(xué)碩士學(xué)位論文⑦中國鹵蟲甘油激酶基因( 彳s 嘶) 在胚胎滯育解除過程中的表達模式分析作者姓名：學(xué)科、專業(yè)：研究方向：導(dǎo)師姓名：程誠海洋生物學(xué)海洋動物發(fā)育與分子遺傳學(xué)侯林教授2014 年3 月遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘 要中國鹵蟲( A r t e m i a s i n i c a ) 廣泛分布于沿海鹽池和內(nèi)陸鹽湖中，是一種廣溫、耐高鹽的小

2、型甲殼動物。鹵蟲具有較強的抗逆能力，在缺氧、高鹽、干燥、低溫、食物匱乏、日照時間縮短等條件下能產(chǎn)出休眠卵，其胚胎發(fā)育被阻滯在原腸胚時期。當(dāng)環(huán)境條件適宜時，休眠卵的滯育解除，胚胎發(fā)育被重新啟動。甘油激酶( g l y c e r o lk i n a s e ，G K ) 催化甘油磷酸化反應(yīng)形成3 ．磷酸甘油，反應(yīng)過程中需M 9 2 + 和A T P 的參與，是甘油利用過程中的限速酶。3 一磷酸甘油是能量代謝及甘油酯的生產(chǎn)過程中一種重要的

3、中問產(chǎn)物。鹵蟲在滯育過程中積累了大量的目‘油作為冷凍保護劑以抵御低溫和干旱的傷害，在胚胎發(fā)育恢復(fù)時，被轉(zhuǎn)化為糖類及其他碳水化合物。因此，甘油激酶在滯育解除過程中發(fā)揮重要作用，但其在中國鹵蟲滯育及滯育解除過程中的作用尚不清楚。本研究采用R A C E 技術(shù)首次得到中國鹵蟲A s - g k 的c D N A 全長，并對其進行了生物信息學(xué)及分子進化方面的分析。爿s _ 積全長2 0 9 6 b p ，包含3 2 6 b p5 ’和l 1 4

4、 b p 3 ’非編碼區(qū)，1 6 5 6 b p 的開放閱讀框。此基因編碼的G K 蛋白含有5 5 1 個氨基酸殘基，包含一個典型的g l y c e r o l k i n a s e 結(jié)構(gòu)域，屬于F G G Y 家族的成員。多序列比對分析表明，G K 作為甘油利用與代謝過程中的關(guān)鍵酶，在進化過程中具有結(jié)構(gòu)與功能上的保守性。利用原位雜交技術(shù)對爿s —辦的表達部位進行了分析，爿s —貼廣泛分布于早期發(fā)育的胚胎( 0 - 2 0 h )

5、。蟲體出現(xiàn)分化后( 4 0 h ) ，頭胸部、腹部、體表、附肢、消化道和卵巢能檢測到陽性信號，與早期哺乳動物和果蠅中對表達部位的研究成果有一定的對應(yīng)關(guān)系。利用原核表達系統(tǒng)在體外誘導(dǎo)表達與純化出了重組A s ．G K 蛋白。采用熒光實時定量P C R 與蛋白免疫印跡技術(shù)，對甘油激酶的表達模式進行了研究。結(jié)果顯示其在鹵蟲胚胎發(fā)育的早期具有較高的表達( 1 0 h ) ，表明甘油激酶作為限速酶，在滯育解除后甘油的分解代謝中發(fā)揮了重要的作用，伴

6、隨滯育期間積累的甘油被逐漸消耗，爿s 私轉(zhuǎn)錄量下調(diào)。爿s ．醇在鹽度刺激與溫度脅迫下的表達模式分析結(jié)果顯示，在鹽度升高或溫度降低時，基因表達顯著上調(diào)，說明A s - g k 對溫度和鹽度的變化有一定的敏感性，在受到低溫和高鹽的脅迫時表達量升高，起到保護胚胎的作用，證明其是與脅迫相關(guān)的蛋白。本研究旨在闡明中國鹵蟲滯育解除及胚胎發(fā)育的早期甘油代謝中G K 的作用，對研究鹵蟲滯育的分子機制具有較為重要的理論意義，對開發(fā)利用鹵蟲資源具有一定的應(yīng)