幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在鹵蟲休眠卵形成過程中的功能研究.pdf

1、鹵蟲，又名鹽水豐年蝦，是廣泛分布于各大洲的鹽湖或鹽田中的一種小型甲殼類生物，因其強(qiáng)大的適應(yīng)極端環(huán)境的能力而被科學(xué)家用來作為極端生物學(xué)的研究材料。鹵蟲具有獨(dú)特的生殖模式:在環(huán)境適宜的條件下，鹵蟲行卵胎生途徑直接產(chǎn)下可游動(dòng)的無節(jié)幼體;在環(huán)境惡劣的條件下，鹵蟲行卵生途徑產(chǎn)下休眠卵。休眠卵的外圍包被有一層厚實(shí)的外殼，在透射電子顯微鏡下呈現(xiàn)明顯的層狀結(jié)構(gòu)，從外向內(nèi)分別是致密的皮質(zhì)層(Cortical layer, CL)，疏松成許多空泡結(jié)構(gòu)的泡層

2、(Alveolar layer, AL)以及最內(nèi)層的胚胎表皮層(Embryonic cuticle layer，ECL)?，F(xiàn)在越來越多的證據(jù)證實(shí)休眠卵殼對休眠卵抵御極端環(huán)境起著不可或缺的作用，但對于休眠卵殼的組成成分和形成機(jī)制的了解卻非常有限。
　　本研究基于卵生鹵蟲和卵胎生鹵蟲的抑制性消減雜交文庫，從中我們篩選了三個(gè)編碼包含幾丁質(zhì)結(jié)合域的基因，并分別命名為鹵蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(Artemiaparthenogenetica chi

3、tin-binding protein，Arp-CBP)基因A，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因B，幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白基因C。我們通過定量PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其為卵生鹵蟲的特異性表達(dá)基因，并且在卵生鹵蟲胚胎發(fā)育后期mRNA大量積累。原位雜交結(jié)果表明這三個(gè)基因由胚胎細(xì)胞表達(dá)。蛋白印跡(Western blotting)實(shí)驗(yàn)顯示這三個(gè)鹵蟲幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白在休眠卵中大量累積。膠體金偶聯(lián)的免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)這三個(gè)蛋白特異性分布于鹵蟲休眠卵殼中的胚胎表皮層，其中Arp

4、-CBP-A蛋白分布在纖維層和外表皮膜上，Arp-CBP-B、Arp-CBP-C蛋白分布在外表皮膜和內(nèi)表皮膜上。
　　通過RNAi技術(shù)我們將Arp-CBP基因進(jìn)行了體內(nèi)沉默實(shí)驗(yàn)，并通過透射電子顯微鏡觀察了干涉組鹵蟲產(chǎn)下的休眠卵的卵殼形態(tài)，發(fā)現(xiàn)將Arp-CBP基因沉默后，鹵蟲休眠卵殼的胚胎表皮層發(fā)生異常，其纖維層變得疏松，外表皮膜和內(nèi)表皮膜變得不規(guī)則。進(jìn)一步，我們通過體外結(jié)合活性檢測發(fā)現(xiàn)這三個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白都有糖結(jié)合活性，由此推測A