含ITIM基序的GP5蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病。機(jī)體感染PRRSV后，誘導(dǎo)遲緩、低水平的中和抗體，而且病毒在機(jī)體內(nèi)持續(xù)感染并引起免疫抑制。PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白在免疫抑制中發(fā)揮重要作用。GP5是由PRRSV的ORF5編碼的含有4個(gè)糖基化位和6個(gè)抗原決定簇的糖基化囊膜蛋白，是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要結(jié)構(gòu)蛋白。GP5是PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中變異最大的蛋白，其編碼201個(gè)氨基酸

2、共603bp，對(duì)其序列進(jìn)行研究與分析發(fā)現(xiàn)其第229-246位氨基酸殘基含有ITIM抑制基序。
　　機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的免疫應(yīng)答過(guò)程能保持適當(dāng)?shù)膹?qiáng)度有賴于負(fù)反饋系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，而免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)在負(fù)向調(diào)節(jié)中發(fā)揮決定性作用。ITIM基序中酪氨酸的磷酸化是免疫抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中最關(guān)鍵的步驟?；罨蟮腎TIM可以成為含SH2結(jié)構(gòu)域的酪氨酸磷酸酶（SHP-1，SHP-2，SH1P）的潛在結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)抑制途徑被激活后，ITIM可以和

3、SHP-1/SHP-2的SH2結(jié)構(gòu)域相結(jié)合而使SHP-1/SHP-2活化。為了揭示PRRSV逃避天然免疫的機(jī)制，本文對(duì)含ITIM基序的GP5蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路進(jìn)行了初步的探索研究。具體內(nèi)容如下:
　　試驗(yàn)一應(yīng)用RT-PCR技術(shù)從Marc145細(xì)胞中克隆出SHP-1、SHP-2結(jié)構(gòu)域基因的cDNA序列，并將其亞克隆到原核表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-SHP-1、pET-SHP-2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在IPTG

4、的誘導(dǎo)下成功表達(dá)分子質(zhì)量大小約為37.5KD、40.1KD的融合蛋白，將純化過(guò)的融合蛋白分別免疫小鼠，制備鼠源血清，采用間接ELISA和Western blotting試驗(yàn)方法檢測(cè)，ELISA測(cè)定多克隆抗體的血清效價(jià)為1∶12800; Westernblotting試驗(yàn)結(jié)果證明，制備的鼠抗pET-SHP-1、pET-SHP-2多克隆抗體可以與重組蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，從而證明重組蛋白具有較好的免疫原性。采用硫酸銨鹽析與DE-52離子交換層

5、析相結(jié)合的方法提取并純化血清得到純度較高的鼠抗SHP-1、SHP-2抗體IgG。結(jié)果驗(yàn)證了Marc145細(xì)胞SHP-1、SHP-2的存在，克隆出了Marc145細(xì)胞SHP-1、SHP-2結(jié)構(gòu)域基因并成功表達(dá)，為后續(xù)試驗(yàn)和研究奠定了基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)二通過(guò)對(duì)GP5基因序列的研究與分析，結(jié)合后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)克隆出GP5基因的cDNA序列并測(cè)序進(jìn)行分析比對(duì)，對(duì)GP5基因進(jìn)行克隆并表達(dá)，通過(guò)基因重組技術(shù)和重疊延伸PCR技

6、術(shù)成功構(gòu)建了GP5基因的真核表達(dá)載體pcDNA-GP5和缺失ITIM基序的pcDNA-GP5△229-246。為后期ITIM基序的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)三通過(guò)PRRSV感染Marc145細(xì)胞和運(yùn)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將成功構(gòu)建的pcDNA-GP5、pcDNA-GP5△229-246真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Marc145細(xì)胞，用本試驗(yàn)建立的real-time PCR方法檢測(cè)Marc145細(xì)胞中SHP-1、SHP-2、IFN-β、NF-κ

7、B mRNA轉(zhuǎn)錄水平，運(yùn)用RT-PCR和Western blotting技術(shù)從mRNA和蛋白水平共同驗(yàn)證了GP5和GP5△229-246在Marc145細(xì)胞中得到有效表達(dá)。用本試驗(yàn)建立的real-time PCR方法檢測(cè)pcDNA-GP5及pcDNA-GP5△229-246轉(zhuǎn)染Marc145細(xì)胞中SHP-1、SHP-2、IFN-β、NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響結(jié)果表明GP5蛋白的ITIM基序可顯著下調(diào)SHP-1的轉(zhuǎn)錄水平，表明GP

8、5蛋白的ITIM基序可抑制SHP-1;而GP5蛋白的ITIM基序總體可顯著上調(diào)SHP-2的轉(zhuǎn)錄水平且在早期明顯升高，表明GP5蛋白的ITIM基序可激活SHP-2，使其介導(dǎo)下游信號(hào)去磷酸化來(lái)發(fā)揮功能作用;同時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果表明GP5蛋白的ITIM基序在24h可顯著下調(diào)IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平，而在36h又顯著上凋IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平，48h IFN-β的轉(zhuǎn)錄水平趨于穩(wěn)定并有降低趨勢(shì)，說(shuō)明GP5蛋白的ITIM基序?qū)FN-β的抑制作用有一定的時(shí)間限

9、制;然而，對(duì)于NF-κB的研究我們不難看出，GP5蛋白的ITIM基序在不同時(shí)間段可顯著下調(diào)NF-κB的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)NF-κB有明顯的抑制作用。因此，含ITIM基序的GP5蛋白可能以依賴ITIM磷酸化的方式與宿主胞內(nèi)酪氨酸磷酸酶SHP-1/SHP-2互作，促進(jìn)SHP-1/SHP-2招募到TRAF6適配體蛋白上，從而抑制TRAF6的泛素化，進(jìn)而抑制NF-κB和MAP激酶的激活。但GP5蛋白的ITIM基序下調(diào)SHP-1轉(zhuǎn)錄水平，而GP5蛋白的