含ITIM基序的GP5蛋白介導的信號通路研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的病毒性傳染病。機體感染PRRSV后，誘導遲緩、低水平的中和抗體，而且病毒在機體內持續(xù)感染并引起免疫抑制。PRRSV結構蛋白及非結構蛋白在免疫抑制中發(fā)揮重要作用。GP5是由PRRSV的ORF5編碼的含有4個糖基化位和6個抗原決定簇的糖基化囊膜蛋白，是誘導中和抗體產(chǎn)生的主要結構蛋白。GP5是PRRSV結構蛋白中變異最大的蛋白，其編碼201個氨基酸

2、共603bp，對其序列進行研究與分析發(fā)現(xiàn)其第229-246位氨基酸殘基含有ITIM抑制基序。
　　機體對外界環(huán)境的免疫應答過程能保持適當?shù)膹姸扔匈囉谪摲答佅到y(tǒng)的調節(jié)，而免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)在負向調節(jié)中發(fā)揮決定性作用。ITIM基序中酪氨酸的磷酸化是免疫抑制信號轉導過程中最關鍵的步驟。活化后的ITIM可以成為含SH2結構域的酪氨酸磷酸酶（SHP-1，SHP-2，SH1P）的潛在結合位點。當抑制途徑被激活后，ITIM可以和

3、SHP-1/SHP-2的SH2結構域相結合而使SHP-1/SHP-2活化。為了揭示PRRSV逃避天然免疫的機制，本文對含ITIM基序的GP5蛋白介導的信號通路進行了初步的探索研究。具體內容如下:
　　試驗一應用RT-PCR技術從Marc145細胞中克隆出SHP-1、SHP-2結構域基因的cDNA序列，并將其亞克隆到原核表達載體pET-32a中，構建重組表達質粒pET-SHP-1、pET-SHP-2，轉化大腸桿菌BL21，在IPTG

4、的誘導下成功表達分子質量大小約為37.5KD、40.1KD的融合蛋白，將純化過的融合蛋白分別免疫小鼠，制備鼠源血清，采用間接ELISA和Western blotting試驗方法檢測，ELISA測定多克隆抗體的血清效價為1∶12800; Westernblotting試驗結果證明，制備的鼠抗pET-SHP-1、pET-SHP-2多克隆抗體可以與重組蛋白進行特異性結合，從而證明重組蛋白具有較好的免疫原性。采用硫酸銨鹽析與DE-52離子交換層

5、析相結合的方法提取并純化血清得到純度較高的鼠抗SHP-1、SHP-2抗體IgG。結果驗證了Marc145細胞SHP-1、SHP-2的存在，克隆出了Marc145細胞SHP-1、SHP-2結構域基因并成功表達，為后續(xù)試驗和研究奠定了基礎。
　　試驗二通過對GP5基因序列的研究與分析，結合后續(xù)的實驗要求，應用RT-PCR技術克隆出GP5基因的cDNA序列并測序進行分析比對，對GP5基因進行克隆并表達，通過基因重組技術和重疊延伸PCR技

6、術成功構建了GP5基因的真核表達載體pcDNA-GP5和缺失ITIM基序的pcDNA-GP5△229-246。為后期ITIM基序的研究奠定了堅實的基礎。
　　試驗三通過PRRSV感染Marc145細胞和運用脂質體轉染法將成功構建的pcDNA-GP5、pcDNA-GP5△229-246真核表達質粒轉染到Marc145細胞，用本試驗建立的real-time PCR方法檢測Marc145細胞中SHP-1、SHP-2、IFN-β、NF-κ

7、B mRNA轉錄水平，運用RT-PCR和Western blotting技術從mRNA和蛋白水平共同驗證了GP5和GP5△229-246在Marc145細胞中得到有效表達。用本試驗建立的real-time PCR方法檢測pcDNA-GP5及pcDNA-GP5△229-246轉染Marc145細胞中SHP-1、SHP-2、IFN-β、NF-κB mRNA轉錄水平的影響結果表明GP5蛋白的ITIM基序可顯著下調SHP-1的轉錄水平，表明GP

8、5蛋白的ITIM基序可抑制SHP-1;而GP5蛋白的ITIM基序總體可顯著上調SHP-2的轉錄水平且在早期明顯升高，表明GP5蛋白的ITIM基序可激活SHP-2，使其介導下游信號去磷酸化來發(fā)揮功能作用;同時，試驗結果表明GP5蛋白的ITIM基序在24h可顯著下調IFN-β的轉錄水平，而在36h又顯著上凋IFN-β的轉錄水平，48h IFN-β的轉錄水平趨于穩(wěn)定并有降低趨勢，說明GP5蛋白的ITIM基序對IFN-β的抑制作用有一定的時間限

9、制;然而，對于NF-κB的研究我們不難看出，GP5蛋白的ITIM基序在不同時間段可顯著下調NF-κB的轉錄水平，對NF-κB有明顯的抑制作用。因此，含ITIM基序的GP5蛋白可能以依賴ITIM磷酸化的方式與宿主胞內酪氨酸磷酸酶SHP-1/SHP-2互作，促進SHP-1/SHP-2招募到TRAF6適配體蛋白上，從而抑制TRAF6的泛素化，進而抑制NF-κB和MAP激酶的激活。但GP5蛋白的ITIM基序下調SHP-1轉錄水平，而GP5蛋白的