TCDCA對TGR5介導的信號通路中AMP含量的影響.pdf

1、體內(nèi)活性物質(zhì)?；蛆Z去氧膽酸(Taurochenodeoxycholic Acid，TCDCA)作為膽汁酸的主要有效成分之一，具有顯著地抗炎免疫調(diào)節(jié)作用。為了深入探討TCDCA的抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的分子機制。本文分析了TCDCA對TGR5介導的信號通路中cAMP含量的影響。其主要研究內(nèi)容如下:
　　(1) NR8383細胞TGR5基因阻斷模型建立的研究
　　采用陽離子脂質(zhì)體法，將TGR5 siRNA轉(zhuǎn)染到NR8383細胞中。實時

2、熒光定量PCR和Western Blot分別檢測了NR8383細胞中TGR5 mRNA和蛋白表達。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染TGR5 siRNA組NR8383細胞上的TGR5 mRNA和蛋白的表達顯著低于對照組（P＜0.01），TGR5 siRNA的沉默率可達80％。
　　(2)穩(wěn)定表達TGR5受體NR8383細胞系的建立
　　將構(gòu)建的真核表達質(zhì)粒pcMV-TGR5轉(zhuǎn)染至NR8383細胞，加入G418篩選了表達TGR5的NR8383細胞

3、系，采用實時熒光定量PCR、Western Blot及免疫熒光技術(shù)檢測了NR8383細胞系中TGR5的表達。結(jié)果顯示，建立的NR8383細胞系中能夠穩(wěn)定表達TGR5。
　　(3) TCDCA對TGR5受體基因沉默及穩(wěn)定表達的NR8383細胞中cAMP含量的影響
　　采用ELISA法分別檢測了TCDCA作用后TGR5基因阻斷的NR8383細胞(TGR5-/-)及穩(wěn)定表達TGR5受體的NR8383細胞中cAMP的含量。結(jié)果表明:

4、一定劑量（濃度）的TCDCA能夠使轉(zhuǎn)染TGR5受體的NR8383細胞產(chǎn)生cAMP。加之不同濃度的TCDCA刺激低表達TGR5受體的NR8383和TGR5受體沉默的NR8383細胞后，均未顯著影響這2種細胞中的cAMP含量，因而提示，TCDCA誘導NR8383-TGR5細胞內(nèi)cAMP水平升高的效應與其激動TGR5有關(guān)。
　　(4) TCDCA對AC阻斷后NR8383-TGR5細胞中cAMP含量的影響
　　通過ELISA法檢測了

5、TGR5受體介導的AC-cAMP信號通路中AC被阻斷后，TCDCA對穩(wěn)定表達TGR5受體的NR8383細胞中cAMP的含量。結(jié)果顯示，在AC特異性抑制劑SQ22，536抑制NR8383-TGR5中的AC活性后，不同濃度的TCDCA對NR8383-TGR5細胞中cAMP的含量均無顯著影響。提示TCDCA對NR8383-TGR5細胞內(nèi)cAMP水平的影響，與AC的活性有關(guān)。
　　(5) TCDCA對PDE4阻斷后NR8383-TGR5細

6、胞中cAMP含量的影響
　　通過ELISA法檢測了TGR5受體介導的AC-cAMP信號通路中PDE4被阻斷后，TCDCA對穩(wěn)定表達TGR5受體的NR8383細胞中cAMP的含量。結(jié)果顯示，在PDE4特異性抑制劑Rolipram抑制PDE活性后，NR8383-TGR5細胞內(nèi)cAMP水平蓄積的基礎(chǔ)上，10μM及100μM濃度的TCDCA仍均能極顯著的提高cAMP的含量。提示，TCDCA引起NR8383-TGR5細胞中cAMP含量的增加

7、，與其激動TGR5，參與了AC-cAMP信號通路有關(guān)。
　　本實驗研究的主要結(jié)論如下:
　　(1)通過RNA干擾技術(shù)成功建立了NR8383大鼠肺泡巨噬細胞TGR5基因阻斷模型;
　　(2)成功建立了穩(wěn)定表達TGR5基因的NR8383細胞系;
　　(3)TCDCA對低表達TGR5受體的NR8383和TGR5受體沉默的NR8383細胞中的cAMP含量均未產(chǎn)生顯著影響;TCDCA降低NR8383-TGR5細胞內(nèi)cAMP