Raf激酶抑制蛋白介導的信號通路對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用.pdf

1、肝細胞癌（HCC）位居世界惡性腫瘤發(fā)病率的第五位，是全球第三位的癌癥死亡原因；HCC是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高，易復發(fā)、轉(zhuǎn)移、預后差的特點。即使施行肝癌根治性切除的肝癌患者，術(shù)后3年生存率只有40-50％，其原因與肝細胞癌易侵襲轉(zhuǎn)移的生物學特性有關(guān)。至今腫瘤轉(zhuǎn)移及其調(diào)控的確切機制仍不清楚，而且無法在臨床上采取有效的治療措施，因此，揭示惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及其調(diào)控的確切分子機制已成為臨床提高腫瘤治療效果的迫切需要，這一領(lǐng)域也成為分

2、子腫瘤學、分子生物學等基礎(chǔ)理論學科研究的熱點。
　　 Raf激酶抑制蛋白（RKIP）屬于高度保守的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（PEBP）家族，廣泛存在于多種生物中。RKIP參與多條信號傳導通路的調(diào)控，在細胞生長、增殖、分化、凋亡等生理過程中發(fā)揮重要作用。最近研究表明RKIP與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但RKIP在肝細胞癌中的作用及其機制如何，目前國內(nèi)外研究報道較少。
　　 本研究首先檢測肝細胞癌組織中RKIP及其可能相關(guān)蛋白P-RKI

3、P、p65和P-ERK的表達，了解RKIP與肝細胞癌臨床病理學特征的關(guān)系及其與P-RKIP、p65和P-ERK的相關(guān)性。其次，通過RKIP基因轉(zhuǎn)染或干擾體外培養(yǎng)的肝癌細胞，觀察上調(diào)或抑制RKIP表達后肝癌細胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，進一步明確RKIP在肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用。最后，檢測RKIP表達或抑制后肝癌細胞Raf-MEK1/2-ERK1/2和NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)蛋白的表達，了解RKIP在肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

4、機制，最終明確肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移是否與RKIP的失活及Raf-MEK1/2-ERK1/2和NF-κB信號轉(zhuǎn)導通路的激活有關(guān)。
　　 第一部分肝癌組織中Raf激酶抑制蛋白的表達及其臨床意義
　　 目的：觀察肝細胞癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織中RKIP及其可能相關(guān)蛋白P-RKIP、p65和P-ERK的表達情況，了解RKIP與肝細胞癌臨床病理學特征的關(guān)系及其與P-RKIP、p65和P-ERK的相關(guān)性。
　　 方法：RT-

5、PCR方法檢測肝細胞癌、癌旁及正常肝組織中RKIP mRNA的表達，免疫組織化學和western方法檢測肝細胞癌、癌旁及正常肝組織中RKIP、P-RKIP、p65和P-ERK蛋白的表達，分析RKIP與肝細胞癌臨床病理學特征的關(guān)系及其與P-RKIP、p65和P-ERK的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1.肝細胞癌、癌旁及正常肝組織中RKIP mRNA表達差異無顯著性說明RKIP的表達可能是在轉(zhuǎn)錄后水平受到調(diào)節(jié)。
　　

6、 2.RKIP和P-RKIP表達的減少或缺失、P65和P-ERK的高表達與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 3.在中高分化肝癌組RKIP和P-RKIP蛋白表達顯著高于低分化組，無肝內(nèi)或淋巴轉(zhuǎn)移組顯著高于有肝內(nèi)或淋巴轉(zhuǎn)移組，而且肝癌組織中RKIP和P-RKIP蛋白表達呈正相關(guān)，提示RKIP和P-RKIP蛋白在抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中共同發(fā)揮作用。
　　 4.P65蛋白表達水平與肝癌分化程度、有無門靜脈或膽管癌栓有關(guān)，P-ERK

7、蛋白表達與肝癌分化程度、有無門靜脈或膽管癌栓以及有無肝內(nèi)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示P65和P-ERK在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用。
　　 5.RKIP與P-ERK的表達呈顯著負相關(guān)，提示RKIP表達的減少或缺失可能通過上調(diào)P-ERK的表達促進肝細胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　 第二部分上調(diào)Raf激酶抑制蛋白的表達對肝癌細胞生物學行為的影響
　　 目的：RKIP表達質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RKIP低表達肝癌細胞株，體內(nèi)外實驗明確RKIP對

8、肝癌細胞增殖、侵襲、凋亡及細胞周期的影響。
　　 方法：RT-PCR和western-blot方法對BEL7402、HepG2、HCCLM3和SMMC7721四種人肝癌細胞株進行檢測，篩選出RKIP低表達肝癌細胞株，行RKIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，G418篩選后，經(jīng)RT-PCR和western-blot方法鑒定，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體和表達RKIP蛋白的細胞克隆。通過MTT法繪制細胞生長曲線，觀察肝癌細胞增殖的變化；流式細胞術(shù)（FCM）觀察RK

9、IP表達對肝癌細胞的細胞周期和凋亡率的影響；通過進行單層細胞劃痕實驗和Matrigel侵襲實驗檢測肝癌細胞遷移能力和侵襲力的變化；對照組和RKIP轉(zhuǎn)染組肝癌細胞接種裸鼠，建立人肝癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察RKIP對肝癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.高轉(zhuǎn)移性肝癌細胞系HCCLM3細胞RKIPmRNA和蛋白低表達，提示RKIP的低表達可能與肝癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為有關(guān)。
　　 2.RK

10、IP基因成功轉(zhuǎn)入并在HCCLM3肝癌細胞中穩(wěn)定表達。
　　 3.RKIP基因轉(zhuǎn)染后，HCCLM3肝癌細胞體外增殖率、細胞的遷移速度和體外侵襲力均明顯降低，說明RKIP表達能抑制HCCLM3肝癌細胞的體外增殖能力和侵襲力。
　　 4.成功建立轉(zhuǎn)染組和對照組HCCLM3人肝癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，結(jié)果顯示RKIP不影響HCCLM3細胞成瘤性，但能夠抑制HCCLM3肝癌細胞的體內(nèi)增殖能力。
　　 5.RKIP對HCC

11、LM3肝癌細胞的細胞周期和凋亡率無影響，說明RKIP表達不能促進HCCLM3肝癌細胞凋亡，RKIP表達抑制HCCLM3肝癌細胞增殖和侵襲力與細胞周期的改變無關(guān)。
　　 第三部分抑制Raf激酶抑制蛋白的表達對肝癌細胞生物學行為的影響
　　 目的：觀察RKIP-siRNA對肝癌細胞中RKIP mRNA及其蛋白表達的抑制作用以及對肝癌細胞生物學行為的影響；同時建立人肝癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察RKIP基因沉默對HepG2細

12、胞體內(nèi)增殖活性的影響。
　　 方法：構(gòu)建RKIP-siRNA和針對性設(shè)計的陰性對照RKIP-ncRNA質(zhì)粒載體，脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染RKIP高表達細胞株HepG2細胞，G418篩選，擴大培養(yǎng)的細胞分別命名為HepG2-NC和HepG2-si。HepG2-NC和HepG2-si細胞經(jīng)RT-PCR和western-blot方法鑒定，觀察RKIP-siRNA是否成功沉默人HepG2肝癌細胞中RKIP基因表達。通過MTT法繪制細胞生長曲線，觀

13、察肝癌細胞增殖的變化；流式細胞術(shù)觀察RKIP表達對肝癌細胞的細胞周期和凋亡率的影響；通過Matrigel侵襲實驗檢測肝癌細胞侵襲力的變化；HepG2-NC和HepG2-si細胞接種裸鼠，建立人肝癌細胞裸鼠皮下移植瘤模型，體內(nèi)實驗觀察RKIP對肝癌細胞增殖的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.RKIP-siRNA成功沉默人HepG2肝癌細胞中RKIP基因。
　　 2.RKIP-siRNA不改變HepG2肝癌細胞的細胞凋

14、亡率和細胞周期，也不影響HepG2肝癌細胞體內(nèi)外的增殖能力，但能夠增強HepG2細胞的體外侵襲能力，說明RKIP基因在抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。
　　 第四部分 Raf激酶抑制蛋白抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機制
　　 目的：以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和RKIP基因的HCCLM3肝癌細胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RKIP-ncRNA質(zhì)粒和RKIP-siRNA質(zhì)粒的HepG2肝癌細胞為研究對象，檢測肝癌細胞Raf-MEK1/2-ERK1/2和NF

15、-κB信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)蛋白的表達，明確RKIP在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制。
　　 方法：
　　 1.HCCLM3-C（對照組）、HCCLM3-RKIP（轉(zhuǎn)染組）、HepG2-NC和HepG2-si肝癌細胞加入NF-κB特異性抑制劑PDTC，48h后EGF處理組加入EGF，激活ERK通路，15分鐘后提取細胞胞漿和胞核蛋白，考馬斯亮蘭法蛋白定量。Western blot檢測P65、ERK和P-ERK蛋白表達，觀察RKIP表達

16、或抑制對肝癌細胞ERK信號通路的影響。
　　 2.HCCLM3-C（對照組）、HCCLM3-RKIP（轉(zhuǎn)染組）、HepG2-NC和HepG2-si組肝癌細胞加入ERK信號通路特異性抑制劑PD98059，48h后TNF-α處理組加入TNF-α，激活NF-κB通路，30分鐘后提取細胞胞漿和胞核蛋白，考馬斯亮蘭法蛋白定量。Western blot檢測P65、ERK和P-ERK蛋白表達，觀察RKIP表達或抑制對肝癌細胞NF-κB通路信號

17、通路的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.RKIP表達不僅能夠抑制HCCLM3細胞ERK的磷酸化，還能夠抑制EGF誘導的HCCLM3細胞ERK的磷酸化，說明RKIP抑制肝癌細胞的增殖和侵襲可能是通過抑制ERK信號通路的活化來實現(xiàn)的。
　　 2.RKIP不僅能夠抑制HCCLM3細胞NF-κB信號通路的活化，還能夠抑制TNF-α對HCCLM3細胞NF-κB信號傳導通路的激活作用，說明RKIP抑制HCCLM3肝癌細胞的增殖