Raf激酶抑制蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的抑制作用.pdf

1、肝細(xì)胞癌（HCC）位居世界惡性腫瘤發(fā)病率的第五位，是全球第三位的癌癥死亡原因；HCC是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的特點(diǎn)。即使施行肝癌根治性切除的肝癌患者，術(shù)后3年生存率只有40-50％，其原因與肝細(xì)胞癌易侵襲轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性有關(guān)。至今腫瘤轉(zhuǎn)移及其調(diào)控的確切機(jī)制仍不清楚，而且無(wú)法在臨床上采取有效的治療措施，因此，揭示惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及其調(diào)控的確切分子機(jī)制已成為臨床提高腫瘤治療效果的迫切需要，這一領(lǐng)域也成為分

2、子腫瘤學(xué)、分子生物學(xué)等基礎(chǔ)理論學(xué)科研究的熱點(diǎn)。
　　 Raf激酶抑制蛋白（RKIP）屬于高度保守的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（PEBP）家族，廣泛存在于多種生物中。RKIP參與多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)控，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。最近研究表明RKIP與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但RKIP在肝細(xì)胞癌中的作用及其機(jī)制如何，目前國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道較少。
　　 本研究首先檢測(cè)肝細(xì)胞癌組織中RKIP及其可能相關(guān)蛋白P-RKI

3、P、p65和P-ERK的表達(dá)，了解RKIP與肝細(xì)胞癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及其與P-RKIP、p65和P-ERK的相關(guān)性。其次，通過(guò)RKIP基因轉(zhuǎn)染或干擾體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞，觀察上調(diào)或抑制RKIP表達(dá)后肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，進(jìn)一步明確RKIP在肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。最后，檢測(cè)RKIP表達(dá)或抑制后肝癌細(xì)胞Raf-MEK1/2-ERK1/2和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，了解RKIP在肝細(xì)胞癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用

4、機(jī)制，最終明確肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移是否與RKIP的失活及Raf-MEK1/2-ERK1/2和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活有關(guān)。
　　 第一部分肝癌組織中Raf激酶抑制蛋白的表達(dá)及其臨床意義
　　 目的：觀察肝細(xì)胞癌組織、癌旁肝組織、正常肝組織中RKIP及其可能相關(guān)蛋白P-RKIP、p65和P-ERK的表達(dá)情況，了解RKIP與肝細(xì)胞癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及其與P-RKIP、p65和P-ERK的相關(guān)性。
　　 方法：RT-

5、PCR方法檢測(cè)肝細(xì)胞癌、癌旁及正常肝組織中RKIP mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)和western方法檢測(cè)肝細(xì)胞癌、癌旁及正常肝組織中RKIP、P-RKIP、p65和P-ERK蛋白的表達(dá)，分析RKIP與肝細(xì)胞癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及其與P-RKIP、p65和P-ERK的相關(guān)性。
　　 結(jié)論：
　　 1.肝細(xì)胞癌、癌旁及正常肝組織中RKIP mRNA表達(dá)差異無(wú)顯著性說(shuō)明RKIP的表達(dá)可能是在轉(zhuǎn)錄后水平受到調(diào)節(jié)。
　　

6、 2.RKIP和P-RKIP表達(dá)的減少或缺失、P65和P-ERK的高表達(dá)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
　　 3.在中高分化肝癌組RKIP和P-RKIP蛋白表達(dá)顯著高于低分化組，無(wú)肝內(nèi)或淋巴轉(zhuǎn)移組顯著高于有肝內(nèi)或淋巴轉(zhuǎn)移組，而且肝癌組織中RKIP和P-RKIP蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示RKIP和P-RKIP蛋白在抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中共同發(fā)揮作用。
　　 4.P65蛋白表達(dá)水平與肝癌分化程度、有無(wú)門靜脈或膽管癌栓有關(guān)，P-ERK

7、蛋白表達(dá)與肝癌分化程度、有無(wú)門靜脈或膽管癌栓以及有無(wú)肝內(nèi)或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示P65和P-ERK在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　 5.RKIP與P-ERK的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，提示RKIP表達(dá)的減少或缺失可能通過(guò)上調(diào)P-ERK的表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　 第二部分上調(diào)Raf激酶抑制蛋白的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 目的：RKIP表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RKIP低表達(dá)肝癌細(xì)胞株，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)明確RKIP對(duì)

8、肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡及細(xì)胞周期的影響。
　　 方法：RT-PCR和western-blot方法對(duì)BEL7402、HepG2、HCCLM3和SMMC7721四種人肝癌細(xì)胞株進(jìn)行檢測(cè)，篩選出RKIP低表達(dá)肝癌細(xì)胞株，行RKIP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，G418篩選后，經(jīng)RT-PCR和western-blot方法鑒定，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空載體和表達(dá)RKIP蛋白的細(xì)胞克隆。通過(guò)MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察肝癌細(xì)胞增殖的變化；流式細(xì)胞術(shù)（FCM）觀察RK

9、IP表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率的影響；通過(guò)進(jìn)行單層細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞遷移能力和侵襲力的變化；對(duì)照組和RKIP轉(zhuǎn)染組肝癌細(xì)胞接種裸鼠，建立人肝癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察RKIP對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.高轉(zhuǎn)移性肝癌細(xì)胞系HCCLM3細(xì)胞RKIPmRNA和蛋白低表達(dá)，提示RKIP的低表達(dá)可能與肝癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性行為有關(guān)。
　　 2.RK

10、IP基因成功轉(zhuǎn)入并在HCCLM3肝癌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。
　　 3.RKIP基因轉(zhuǎn)染后，HCCLM3肝癌細(xì)胞體外增殖率、細(xì)胞的遷移速度和體外侵襲力均明顯降低，說(shuō)明RKIP表達(dá)能抑制HCCLM3肝癌細(xì)胞的體外增殖能力和侵襲力。
　　 4.成功建立轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組HCCLM3人肝癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，結(jié)果顯示RKIP不影響HCCLM3細(xì)胞成瘤性，但能夠抑制HCCLM3肝癌細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力。
　　 5.RKIP對(duì)HCC

11、LM3肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率無(wú)影響，說(shuō)明RKIP表達(dá)不能促進(jìn)HCCLM3肝癌細(xì)胞凋亡，RKIP表達(dá)抑制HCCLM3肝癌細(xì)胞增殖和侵襲力與細(xì)胞周期的改變無(wú)關(guān)。
　　 第三部分抑制Raf激酶抑制蛋白的表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 目的：觀察RKIP-siRNA對(duì)肝癌細(xì)胞中RKIP mRNA及其蛋白表達(dá)的抑制作用以及對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響；同時(shí)建立人肝癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，觀察RKIP基因沉默對(duì)HepG2細(xì)

12、胞體內(nèi)增殖活性的影響。
　　 方法：構(gòu)建RKIP-siRNA和針對(duì)性設(shè)計(jì)的陰性對(duì)照RKIP-ncRNA質(zhì)粒載體，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染RKIP高表達(dá)細(xì)胞株HepG2細(xì)胞，G418篩選，擴(kuò)大培養(yǎng)的細(xì)胞分別命名為HepG2-NC和HepG2-si。HepG2-NC和HepG2-si細(xì)胞經(jīng)RT-PCR和western-blot方法鑒定，觀察RKIP-siRNA是否成功沉默人HepG2肝癌細(xì)胞中RKIP基因表達(dá)。通過(guò)MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀

13、察肝癌細(xì)胞增殖的變化；流式細(xì)胞術(shù)觀察RKIP表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡率的影響；通過(guò)Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌細(xì)胞侵襲力的變化；HepG2-NC和HepG2-si細(xì)胞接種裸鼠，建立人肝癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察RKIP對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.RKIP-siRNA成功沉默人HepG2肝癌細(xì)胞中RKIP基因。
　　 2.RKIP-siRNA不改變HepG2肝癌細(xì)胞的細(xì)胞凋

14、亡率和細(xì)胞周期，也不影響HepG2肝癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖能力，但能夠增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的體外侵襲能力，說(shuō)明RKIP基因在抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。
　　 第四部分 Raf激酶抑制蛋白抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制
　　 目的：以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和RKIP基因的HCCLM3肝癌細(xì)胞、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染RKIP-ncRNA質(zhì)粒和RKIP-siRNA質(zhì)粒的HepG2肝癌細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)肝癌細(xì)胞Raf-MEK1/2-ERK1/2和NF

15、-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，明確RKIP在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.HCCLM3-C（對(duì)照組）、HCCLM3-RKIP（轉(zhuǎn)染組）、HepG2-NC和HepG2-si肝癌細(xì)胞加入NF-κB特異性抑制劑PDTC，48h后EGF處理組加入EGF，激活ERK通路，15分鐘后提取細(xì)胞胞漿和胞核蛋白，考馬斯亮蘭法蛋白定量。Western blot檢測(cè)P65、ERK和P-ERK蛋白表達(dá)，觀察RKIP表達(dá)

16、或抑制對(duì)肝癌細(xì)胞ERK信號(hào)通路的影響。
　　 2.HCCLM3-C（對(duì)照組）、HCCLM3-RKIP（轉(zhuǎn)染組）、HepG2-NC和HepG2-si組肝癌細(xì)胞加入ERK信號(hào)通路特異性抑制劑PD98059，48h后TNF-α處理組加入TNF-α，激活NF-κB通路，30分鐘后提取細(xì)胞胞漿和胞核蛋白，考馬斯亮蘭法蛋白定量。Western blot檢測(cè)P65、ERK和P-ERK蛋白表達(dá)，觀察RKIP表達(dá)或抑制對(duì)肝癌細(xì)胞NF-κB通路信號(hào)

17、通路的影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.RKIP表達(dá)不僅能夠抑制HCCLM3細(xì)胞ERK的磷酸化，還能夠抑制EGF誘導(dǎo)的HCCLM3細(xì)胞ERK的磷酸化，說(shuō)明RKIP抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲可能是通過(guò)抑制ERK信號(hào)通路的活化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
　　 2.RKIP不僅能夠抑制HCCLM3細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路的活化，還能夠抑制TNF-α對(duì)HCCLM3細(xì)胞NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活作用，說(shuō)明RKIP抑制HCCLM3肝癌細(xì)胞的增殖