豬繁殖與呼吸綜合征病毒Nsp2、GP5和N蛋白單克隆抗體的制備.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Productive and Respiratory Syndrome，PRRS）是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，造成了巨大的經(jīng)濟損失。其病原為豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine Productive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV)，歸屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬。但由于PRRSV擁有嚴格的宿主細胞特異性、抗體依賴性增強作用、廣泛的毒株變異現(xiàn)象和持續(xù)

2、性感染等特性而使針對該病的免疫預防沒有得到任何實質(zhì)性突破。
　　 本研究旨在(1)探明浙江地區(qū)PRRSV Nsp2基因的分子變異特征;(2)制備Nsp2、GP5和N蛋白的單克隆抗體;(3)建立PRRSV N蛋白的Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)。
　　 1.應用RT-PCR方法對2008-2009年采集于浙江省部分發(fā)病豬場的41份疑似PRRS病豬的脾、肺及淋巴結混合組織樣本進行PRRSV Nsp2基因序列分析。結果顯

3、示，41份PRRSV分離毒株中有20份Nsp2部分缺失，與國內(nèi)分離毒株JXA1、HuN、HUN4等具有相同的缺失特征。41個分離株間同源性高達89.2％～100％，其中20個缺失株間的核苷酸同源性為94.2％～99.8％;21個非缺失株間的核苷酸同源性為99.2％～100％。
　　 2.將原核表達的重組Nsp2、GP5和N蛋白作為抗原免疫BALB/c小鼠，取脾細胞和骨髓瘤細胞融合，ELISA和IFA鑒定陽性后有限稀釋法篩選單克隆

4、，獲得4株抗Nsp2、1株抗GP5和1株抗N蛋白的特異性單抗，命名為Nsp2:1A5、1D8、1F1和3H7，GP5:4A3，N:5E10。4株抗Nsp2和1株抗N蛋白的單抗均能通過ELISA、IFA和Western blot方法鑒定，測定ELISA效價為(Nsp2:1∶20000;N:1∶1000)，說明識別抗原線性表位;1株抗GP5單抗并不能通過ELISA和Western blot方法鑒定，其IFA效價為1∶500，說明識別抗原構象

5、表位。
　　 3.RT-PCR方法擴增PRRSV JX株N蛋白基因，將其克隆于質(zhì)粒pFastBacTMHTA中，構建的重組供體質(zhì)粒pFastBacTM HT A-N轉(zhuǎn)化于DH10Bac感受態(tài)細胞中發(fā)生轉(zhuǎn)座，得到的重組轉(zhuǎn)座子reBacmid-N轉(zhuǎn)染至昆蟲細胞sf9中，并進行重組桿狀病毒的包裝。通過SDS-PAGE、Western-blot和IFA試驗對所表達的蛋白進行鑒定和反應原性分析。結果顯示，經(jīng)Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)