豬繁殖與呼吸綜合征病毒N、GP5蛋白的表達(dá)、純化及結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的傳染病.由PRRSV基因組ORF5、ORF7編碼的GP5、N蛋白是其主要的結(jié)構(gòu)蛋白.該研究通過構(gòu)建PRRSV BJ-4株ORF5、ORF7不同的原核表達(dá)載體,應(yīng)用不同的純化方法,獲得高純度的重組表達(dá)蛋白,通過對純化蛋白的圓二色譜(CD)分析,繪制出GP5、N蛋白的二級結(jié)構(gòu)圖,從結(jié)構(gòu)生物學(xué)的角度分析了PRRSV N、GP5蛋白結(jié)構(gòu)與功

2、能的關(guān)系.分別應(yīng)用pGEX-6P-1、pET28a表達(dá)載體,獲得核衣殼蛋白N的可溶性表達(dá).將豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)PRRS BJ-4株N基因克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1,重組質(zhì)粒pGEX-6P-N在E.coliBL21細(xì)胞中可溶性表達(dá)融和蛋白GST-N,經(jīng)GST親和層析獲得重組蛋白GST-N,應(yīng)用Prescission Protease切割獲得純化的N蛋白;將BJ-4株N基因克隆至原核表達(dá)載體pET28a,得到重組

3、表達(dá)載體pET28-N,轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)細(xì)胞,獲得可溶性表達(dá),表達(dá)量占菌體蛋白的28﹪.經(jīng)Proband Ni<'2+>親和層析獲得重組蛋白P28-N.通過生物信息分析,應(yīng)用pGEX-6P-1、pET32a表達(dá)載體,分別構(gòu)建了缺失信號肽的GP5蛋白及缺失跨膜域的GP5突變體原核表達(dá)載體pGEX-6P-dE、pGEX-6P-dEM、pET21-dEM,表達(dá)量分別為16﹪,32﹪,50﹪.進(jìn)一步通過包涵體變性復(fù)性、分子篩

4、凝膠層析、GST親和層析獲得純化的重組表達(dá)蛋白GST-dE、GST-dEM和P32-dEM.應(yīng)用圓二色譜測定純化的P28-N、GST-dE、GST-dEM等蛋白,計(jì)算相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)組成,結(jié)合生物信息學(xué)分析,繪制出GP5、N蛋白的二級結(jié)構(gòu)圖.對P28-N重組蛋白的CD分析表明,P28-N中α螺旋、β折疊、T-轉(zhuǎn)角、蜷曲分別為26.1﹪,23.7﹪,19.8﹪和30.3﹪;根據(jù)PDB中PRRSV VR2332株N蛋白C端部分三級結(jié)構(gòu),經(jīng)同源

5、模建繪制了BJ-4株相應(yīng)域的三級結(jié)構(gòu);結(jié)合P28-N的結(jié)構(gòu)預(yù)測,繪制出PRRSVN蛋白的二級結(jié)構(gòu)圖.N蛋白二級結(jié)構(gòu)中,α螺旋由40個aa組成,形成2條β鏈(12aa),含有多處β轉(zhuǎn)角(14aa).圓二色譜對GST-dEM蛋白的分析表明,GST-dEM含有44﹪(155aa)的α螺旋,14.4﹪的β鏈(約50aa).應(yīng)用PDB中已解析的部分GST結(jié)構(gòu)信息校正融合分子的結(jié)構(gòu);通過多種結(jié)構(gòu)預(yù)測方法比較,確定共同保守域的二級結(jié)構(gòu);結(jié)合圓二色譜二

6、級結(jié)構(gòu)的檢測結(jié)果,進(jìn)一步繪制出PRRSV BJ-4 GP5蛋白的二級結(jié)構(gòu)圖.GP5蛋白α螺旋約58aa,β鏈約56aa,β轉(zhuǎn)角14aa,其它為無規(guī)則蜷曲.根據(jù)N、GP5的二級結(jié)構(gòu),從結(jié)構(gòu)的角度分析了PRRSV GP5、N蛋白結(jié)構(gòu)與其功能的關(guān)系.N蛋白的二級結(jié)構(gòu)與其參與病毒核衣殼的形成、NLS穿梭運(yùn)轉(zhuǎn)功能及其線性表位的形成等功能密切相關(guān),N蛋白3個α螺旋區(qū)及β鏈對N蛋白衣殼的結(jié)構(gòu)形成起重要作用.通過對GP5二級結(jié)構(gòu)的分析,為PRRSV G