卵黃高磷蛋白對雞胚胎骨骼發(fā)育的影響.pdf

1、雞蛋中的卵黃高磷蛋白(phosvitin)是已知所有蛋白質(zhì)中磷酸化程度最高的蛋白質(zhì)，含磷量占蛋黃總磷量的80％，是雞胚骨骼發(fā)育中礦物質(zhì)磷的主要來源。本文以phosvitin作為研究對象，圍繞著phosvitin對雞胚胎骨骼發(fā)育的影響開展了系列工作。主要研究內(nèi)容和研究成果摘要如下:
　　研究了雞胚胎發(fā)育期間與骨骼發(fā)育相關(guān)指標的變化規(guī)律。發(fā)現(xiàn)雞胚胎發(fā)育9-10d是一個轉(zhuǎn)折點:蛋清pH在9d胚齡以后，逐漸趨于穩(wěn)定，保持在pH7.5左右;

2、蛋黃pH在10d胚齡時突然上升，達到最大值8.19，之后呈小幅度下降，在pH7.5附近相對穩(wěn)定;蛋黃總磷含量在10d胚齡時出現(xiàn)急劇下降，這與胚胎在9d胚齡開始骨化有很大相關(guān)性。比較分析蛋黃磷含量的降低速率、堿性磷酸酶活力變化以及雞胚體長的增長發(fā)現(xiàn)三者的變化趨勢基本一致，先上升后下降。在14-16d總磷下降速率最快，平均達到0.027mg/g.d，ALP活力也達到最大值1.12U/gprot，體長增長率的變化有一定滯后，在17d胚齡增長率

3、達到最大，1.17cm/d，這與蛋黃中的磷被轉(zhuǎn)移到胚胎然后被胚胎骨骼發(fā)育利用需要一定時間有關(guān)。
　　研究了胚胎發(fā)育的9-20d phosvitin的變化。變性凝膠電泳和非變性凝膠電泳的實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)了胚胎發(fā)育期間phosvitin分子量逐漸下降，磷氮比的測定結(jié)果和對紅外原始圖譜的分析都證明了孵化期間phosvitin磷酸根含量下降，通過紅外光譜和圓二色譜數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)phosvitin二級結(jié)構(gòu)在孵化期間γ-無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)

4、向α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，phosvitin向有序性變化。綜合分析P/N比、二級結(jié)構(gòu)、與上一章中的ALP、體長增長率，這些指標的變化最快最高的階段在時間和區(qū)間上都表現(xiàn)出一致性，在13-16d胚齡phosvitin的磷酸根含量降低最明顯，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有序性增強，γ-無規(guī)則卷曲和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)向α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了轉(zhuǎn)化，堿性磷酸酶、雞胚體長大幅度的增加。證明了在phosvitin與雞胚骨骼發(fā)育密切相關(guān)，并且是通過脫磷酸化提供雞胚骨骼形成需要的磷。

5、
　　研究了0、50、100、500、1000μg/mL phosvitin處理MC3T3-E1細胞24h、48h后對細胞生長影響。CCK-8法檢測phosvitin對MC3T3-E1細胞的增殖活力的影響，流式細胞儀法分析了phosvitin對細胞細胞周期和細胞凋亡的影響，結(jié)果表明:低濃度蛋白可以促進增殖，抑制細胞凋亡;高濃度蛋白會抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡。phosvitin濃度100μg/mL時效果最好。100μg/mL ph

6、osvitin處理MC3T3-E1細胞48h后:細胞增殖活力達到108.61％，細胞增殖率達到23.49％，顯著高于對照組及高濃度組;細胞正在凋亡率為6.42％，已經(jīng)凋亡率為2.47％，顯著低于對照組和高濃度組。
　　研究了空白、Pv、Pv+Vc、Pv+β-GP、Vc+β-GP5種礦化誘導劑對MC3T3-E1細胞礦化的影響。實驗首先確立誘導礦化實驗中最佳接種密度為1×104/cm2。對誘導礦化期間細胞內(nèi)ALP活力、礦化結(jié)節(jié)含量以及

7、相關(guān)基因表達量結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)phosvitin單獨誘導不能引起細胞礦化但是可以促進細胞成骨活動，21d時ALP活力達到1.0U/gprot，顯著高于陰性對照組，并且顯著上調(diào)Col-ⅠmRNA、OCN mRNA的表達，對Runx-2 mRNA、BMP-2 mRNA表達量的影響較弱，茜素紅染色結(jié)果呈陰性。Pv+β-GP組可以誘導礦化，21d時ALP活力達到2.1U/gprot，稍低于陽性對照組，對Runx-2 mRNA、BMP-2 mRNA、