ZFNs介導(dǎo)的牛MSTN位點(diǎn)的基因打靶研究.pdf

1、鋅指核酶技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基因打靶技術(shù)，能夠特異性識(shí)別基因組內(nèi)的位點(diǎn)，并在識(shí)別位點(diǎn)對(duì)DNA進(jìn)行剪切，形成雙鏈斷裂(DSB)。DSB通過(guò)非同源性末端連接(NHEJ)或同源重組(HR)的方式進(jìn)行修復(fù)。通過(guò)NHEJ方式修復(fù)DSB時(shí)，可能會(huì)引入堿基的插入或缺失，造成基因突變。而通過(guò)HR方式修復(fù)時(shí)，不會(huì)引起突變，但當(dāng)存在含有同源臂的外源基因時(shí)，可能會(huì)將外源基因整合到該位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)基因打靶。
　　本研究首先分離了牛成纖維細(xì)胞、肌肉間充質(zhì)細(xì)胞

2、和脂肪間充質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞都能夠在DMEM培養(yǎng)基和10％胎牛血清構(gòu)成的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代。通過(guò)分化培養(yǎng)，牛肌肉間充質(zhì)細(xì)胞能夠分化為肌管細(xì)胞和脂肪細(xì)胞;脂肪間充質(zhì)細(xì)胞能夠分化為脂肪細(xì)胞，脂肪滴能被油紅O染色，并且在分化形成的肌肉細(xì)胞中能夠觀察到肌管細(xì)胞的收縮現(xiàn)象。對(duì)兩種間充質(zhì)細(xì)胞使用Vimentin抗體進(jìn)行免疫熒光染色，可以發(fā)現(xiàn)二者都具有Vimentin的表達(dá)，說(shuō)明這些細(xì)胞具備間充質(zhì)細(xì)胞的性質(zhì)。牛肌肉間充質(zhì)細(xì)胞能夠表達(dá)MYOG、MYO

3、D和MYF5三種肌源基因。從胎兒耳部組織獲得的成纖維細(xì)胞具有典型的成纖維細(xì)胞特征。選取牛成纖維細(xì)胞和牛肌肉間充質(zhì)細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的主要材料。
　　本研究設(shè)計(jì)了兩組針對(duì)牛肌肉抑制素基因(Myostatin，MSTN)第二外顯子的ZFNs(bZFNs-P1和bZFNs-P2)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將ZFNs載體轉(zhuǎn)入牛成纖維細(xì)胞和肌肉間充質(zhì)細(xì)胞中，通過(guò)PCR和測(cè)序檢測(cè)突變體，最終獲得了18個(gè)突變體細(xì)胞系(bZFNs-P1獲得14個(gè)敲除細(xì)

4、胞系，bZFNs-P2獲得4個(gè)敲除細(xì)胞系，包括一株雙等位基因敲除細(xì)胞系)。兩組ZFNs的敲除效率分別為6.05％和3.84％。選取其中一株突變細(xì)胞系KO-241，檢測(cè)核型正常后，作為體細(xì)胞核移植供體細(xì)胞，制備了24枚重構(gòu)胚。獲得的重構(gòu)胚去除透明帶后，培養(yǎng)于2i培養(yǎng)液環(huán)境下的牛成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層上，獲得了牛滋養(yǎng)層干細(xì)胞。牛滋養(yǎng)層干細(xì)胞呈球狀和片狀生長(zhǎng)。其MSTN位點(diǎn)的突變類(lèi)型與供體細(xì)胞相同。
　　為了提高牛肌間不飽和脂肪酸的含量，同時(shí)

5、研究鋅指核酶在牛成纖維細(xì)胞中介導(dǎo)的基因打靶效率，設(shè)計(jì)構(gòu)建了兩個(gè)針對(duì)bZFNs-P2靶向位點(diǎn)的打靶質(zhì)粒，分別為pflrkt-1和pGlrkt-1，其外源基因分別為人源化的Fat-1（hFat-1)和EGFP，兩側(cè)都帶有800-900bp的同源臂，用于將外源基因整合到MSTN基因第二外顯子。由于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率不足以實(shí)現(xiàn)三個(gè)以上質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，所以首先優(yōu)化了牛成纖維細(xì)胞的電轉(zhuǎn)染條件，在使用電壓為200V，脈沖時(shí)間為5ms，脈沖次數(shù)為2次的條件下，

6、獲得了最高的約60％的轉(zhuǎn)染效率。之后利用電轉(zhuǎn)染方式將3個(gè)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入牛成纖維細(xì)胞。經(jīng)過(guò)G418篩選和同源臂跨臂PCR檢測(cè)，共獲得了2株打靶細(xì)胞34f6和34GF8。打靶效率為10％和7％。34GF8細(xì)胞系在熒光顯微鏡下能夠觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，而通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)34f6的hFat-1基因表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，該基因能夠在MSTN位點(diǎn)表達(dá)。
　　本研究利用ZFNs技術(shù)成功將牛MSTN進(jìn)行突變，獲得了18株突變細(xì)胞系（包含一株雙等位基