CRISPR-Cas9與TALENs介導(dǎo)奶山羊β-酪蛋白位點(diǎn)基因打靶效率的比較研究.pdf

1、由sgRNA指導(dǎo)Cas9內(nèi)切酶從而特異性的識(shí)別基因位點(diǎn)并進(jìn)行編輯的CRISPR/Cas9是近年興起的一項(xiàng)新技術(shù)，相較于之前的鋅指核酸酶技術(shù)(Zinc finger nuclease，ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活子因子效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs），CRISPR/Cas9在設(shè)計(jì)、使用方面更加簡(jiǎn)便快捷，并且不需要對(duì)序列進(jìn)行特殊分析，也不需要對(duì)應(yīng)地去尋找

2、識(shí)別模塊，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到純合子突變體，而且可以在不同的位點(diǎn)同時(shí)引入多個(gè)突變，其具有極大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。
　　本實(shí)驗(yàn)是針對(duì)β-酪蛋白(β-casein，CSN2)的第二外顯子的一段序列設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一組TALENs表達(dá)載體和一個(gè)CRISPR/Cas9表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)選用了具有新霉素抗性基因(Neor)表達(dá)框架的質(zhì)粒為骨架，構(gòu)建了兩個(gè)針對(duì)TALENs、CRISPR/Cas9切割位點(diǎn)的同源打靶載體，分別為p

3、Flrkt和pGlrkt。其外源基因分別為人源化的Fat-1(hFat-1)和EGFP，在CAGG啟動(dòng)子上游包含長(zhǎng)1024bp的5'同源臂，在(Neor)表達(dá)框架下游包含長(zhǎng)1028bp的3'同源臂。限制性酶切片段分析及序列測(cè)定分析的結(jié)果表明，所構(gòu)建載體含有正確的CSN2同源片段和外源基因，可用于將外源基因hfat-1和GFP靶向整合到CSN2基因的第二外顯子。
　　為了檢測(cè)TALENs與CRISPR/Cas9介導(dǎo)的外源基因的整合效

4、率，通過電轉(zhuǎn)染方法將TALENs: pFlrkt/pGlrk和CRISPR/Cas9: pFlrkt/pGlrkt質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到奶山羊的胎兒成纖維細(xì)胞中，在經(jīng)過G418篩選后，一部分鏟取細(xì)胞集落，另一部分采用流式分選的方法挑取單克隆細(xì)胞，再經(jīng)過同源臂跨臂PCR檢測(cè)，最終獲得外源基因定點(diǎn)整合細(xì)胞系。經(jīng)過鑒定，在鏟取細(xì)胞集落中所得到的68株TALENs介導(dǎo)的pFlrkt定點(diǎn)整合細(xì)胞系中共獲得18株打靶細(xì)胞，pGlrkt定點(diǎn)整合的34株細(xì)胞系中獲

5、得11株打靶細(xì)胞，打靶效率分別為26.47％和32.35％;在采用流式分選的方法得到23株TALENs介導(dǎo)的pFlrkt定點(diǎn)整合細(xì)胞系中共獲得5株打靶細(xì)胞，其打靶效率為21.74％;在鏟取的細(xì)胞集落中采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)的pFlrkt載體定點(diǎn)整合的35株細(xì)胞系中獲得26株打靶細(xì)胞，pGlrkt載體定點(diǎn)整合的27株細(xì)胞系中獲得19株打靶細(xì)胞，其打靶效率分別為74.29％和70.37％;在采用流式分選的方法所得到的17株CRISP

6、R/Cas9介導(dǎo)的pFlrkt定點(diǎn)整合細(xì)胞系中共獲得10株打靶細(xì)胞，其打靶效率為58.82％。實(shí)驗(yàn)證明，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因打靶效率要高于TALENs。
　　本實(shí)驗(yàn)最終獲得59株fat-1定點(diǎn)整合細(xì)胞系，這些細(xì)胞為今后的體細(xì)胞核移植、胚胎移植提供了可選的供體細(xì)胞。獲得這種敲除β-酪蛋白基因的奶山羊品種，能夠提高羊奶品質(zhì)，降低羊奶加工難度。同時(shí)實(shí)驗(yàn)證明，在奶山羊上，CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因打靶效率要高于TALEN