Rho-ROCK信號通路對舌癌F-肌動蛋白細(xì)胞骨架的影響.pdf

1、舌癌是口腔頜面部惡性腫瘤中最常見的口腔癌，其構(gòu)成比在國內(nèi)外均居第一。一般惡性程度較高，生長快，浸潤性強(qiáng)。舌癌常早期發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移率較高，有文獻(xiàn)報道高達(dá)60-80％，嚴(yán)重影響治療效果，危害極大。近來的統(tǒng)計資料表明，舌癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢，而且發(fā)病年齡趨向年輕化。但因其部位和功能的特殊，手術(shù)治療容易造成毀傷和功能障礙，對人體的身心健康危害較大。因此，為提高舌癌的治愈率和生存率，提高患者的生活質(zhì)量，分子靶向藥物治療作為生物治療

2、的重要組成部分也越來越受到重視，使得腫瘤的生物學(xué)治療成為繼手術(shù)、放療和化療之后的第四種治療方法。故對舌癌侵襲機(jī)制和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究越來越重視。尤其在細(xì)胞分子水平上，對舌癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從不同的方面取得了令人注目的進(jìn)展。近年來發(fā)現(xiàn)Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一個重要的信號通路，它的主要功能是調(diào)節(jié)肌動蛋白和細(xì)胞骨架重組，而細(xì)胞骨架的變化影響細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)變化和運(yùn)動。F-肌動蛋白細(xì)胞骨架不僅在細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞運(yùn)動中

3、有重要作用，還在細(xì)胞的各種生命活動如細(xì)胞增殖、細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮重要作用。此外，Rho/ROCK通路還參與細(xì)胞周期的調(diào)控和抑制細(xì)胞凋亡等。侵襲和轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性程度的重要標(biāo)志，也是患者死亡的主要原因。由于舌癌早期易發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因而對于舌癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究成為腫瘤學(xué)家和口腔醫(yī)學(xué)專家研究的熱點(diǎn)。
　　 本實驗研究旨在通過應(yīng)用Rho/ROCK信號通路的特異性抑制劑Y-27632，用不同的濃度作用于體外培養(yǎng)的人舌癌Tca81

4、13細(xì)胞，阻斷Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使用免疫熒光技術(shù)，通過激光掃描共聚焦顯微鏡，觀察舌癌細(xì)胞內(nèi)F-肌動蛋白數(shù)量和排列分布的變化、細(xì)胞骨架的重構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的變化。同時，采用流式細(xì)胞術(shù)，對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測，分析G1、S和G2/M期的細(xì)胞分布，觀察Rho/ROCK通路對細(xì)胞周期的調(diào)控的影響，探討其作用機(jī)制，為預(yù)防和治療舌癌的侵襲、轉(zhuǎn)移提供一種新的治療思路和方法。
　　 目的：
　　 應(yīng)用Rho/ROCK信號通路

5、的特異性抑制劑Y-27632，探討Rho/ROCK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對舌鱗癌F-肌動蛋白細(xì)胞骨架及對細(xì)胞周期的調(diào)控的影響。
　　 材料與方法：
　　 用不同藥物濃度的Rho/ROCK通路特異性抑制劑Y-27632（5μmol/L，11μmol/L，25μmol/L，50μmol/L）作用于體外培養(yǎng)的人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞株24小時，用FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽標(biāo)記F-肌動蛋白，PI標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)DNA，通過激光掃描共聚焦顯微鏡和免

6、疫細(xì)胞化學(xué)法，觀察舌癌細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)F-肌動蛋白排列、分布和含量的變化。同時，采用流式細(xì)胞術(shù)，對細(xì)胞內(nèi)DNA含量進(jìn)行檢測，分析細(xì)胞周期G1、S和G2/M各期的細(xì)胞分布。
　　 結(jié)果：
　　 1.倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞為上皮樣細(xì)胞形態(tài)，呈扁平、多角形、圓形、不規(guī)則性、梭性等多種形態(tài)，細(xì)胞異型性明顯，多核、核分裂像少見；核漿比例增加，可見少量巨核細(xì)胞。
　　 2.激光掃描共聚焦顯微鏡下舌癌細(xì)胞的形態(tài)：Tca811

7、3細(xì)胞為不規(guī)則形，細(xì)胞內(nèi)微絲為粗大的較長的束狀纖維，細(xì)胞膜伸出大量突起，其中許多微絲深入到細(xì)胞突起，即F-actin小體。細(xì)胞內(nèi)F-actin微絲形成束狀纖維，平行排列或縱橫交錯成網(wǎng)狀貫穿整個細(xì)胞。Tca8113細(xì)胞actin聚集形成F-actin小體，大量的F-actin趨向于胞周分布，形成F-actin環(huán)，細(xì)胞核大，極性增強(qiáng)，偏向一側(cè)，可見多個核仁。微絲在細(xì)胞的表面突起，排列形成許多微刺突、絲狀偽足和片狀偽足。經(jīng)5μmol/L和10

8、μmol/L，處理后，細(xì)胞形態(tài)略有收縮，與對照組相比，變化不甚明顯；經(jīng)25μmol/L，和50μmol/L處理后，細(xì)胞形態(tài)收縮，細(xì)胞生長稀疏，形狀變規(guī)則，呈橢圓形或圓形，綠色熒光染色的F-actin顯著減少，胞漿中所顯示的微絲較短或消失，多呈直纖維狀線型熒光，且數(shù)量明顯減少，排列較稀疏，不規(guī)則，細(xì)胞邊緣顯示較強(qiáng)的熒光帶或熒光環(huán)。
　　 3.SP免疫細(xì)胞化學(xué)法光鏡下舌癌細(xì)胞的形態(tài)：見細(xì)胞呈圓形、橢圓形，細(xì)胞異型性不明顯，核漿比例增

9、加，胞核偏向一側(cè)，可見少量巨核細(xì)胞，多核、核分裂像少見。
　　 4.平均熒光強(qiáng)度法和免疫細(xì)胞化學(xué)法測定F-肌動蛋白含量：實驗組與對照組相比，均明顯降低（P值均<0.01），差異具有顯著性意義。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期G1、S和G2/M各期的細(xì)胞分布結(jié)果：與對照組相比，除實驗組（5μmol/L）P>0.05外，其他各實驗組，隨Y-27632濃度的增大，使滯留在G1期的細(xì)胞數(shù)量顯著增多，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異有顯著性（

10、P值均<0.01），說明G1期的變化與抑制劑Y-27632濃度呈正相關(guān)系，與細(xì)胞內(nèi)微絲結(jié)構(gòu)發(fā)生改變相一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.Rho/ROCK信號通路參與人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞F-肌動蛋白細(xì)胞骨架的重構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)的改變；
　　 2.F-肌動蛋白含量的變化與Rho/ROCK信號通路的特異性抑制劑Y-27632的濃度呈負(fù)相關(guān)系；
　　 3.Rho/ROCK信號通路也參與人舌鱗癌Tca8113細(xì)胞周期