小鼠IL-33的原核表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備與應(yīng)用研究.pdf

1、白細(xì)胞介素(IL)-33 是2005年Schmitz 等使用計算機(jī)序列分析、發(fā)現(xiàn)并鑒定的一種前炎癥細(xì)胞因子。它的基因序列和結(jié)構(gòu)與IL-1 家族成員IL-1 β和IL-18 最為相似，屬于IL-1 家族的一個新成員，也被稱為IL-1F11。IL-33 mRNA 在小鼠胃、肺、脊髓、腦、皮膚等組織及靜止樹突狀細(xì)胞、活化的巨噬細(xì)胞高表達(dá)，在人平滑肌細(xì)胞及支氣管或小氣道上皮細(xì)胞為組成性表達(dá)。IL-33與其受體ST2 結(jié)合，活化核因子(NF)-κ

2、 B和絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)，誘導(dǎo)輔助性T 細(xì)胞(Th)2 細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在多種炎癥與免疫過程中發(fā)揮重要作用。
　　 目前，關(guān)于IL-33 功能的研究在國內(nèi)外都尚處于發(fā)展階段。本研究用分子生物學(xué)技術(shù)克隆小鼠IL-33基因，通過構(gòu)建其真核及原核表達(dá)載體、原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IL-33 蛋白及其兔抗多克隆抗體的制備，探討小鼠IL-33 蛋白在不同組織中的表達(dá)分布及IL-33 在不同疾病動物模型中的作用，為進(jìn)一步研究其功能奠定

3、了基礎(chǔ)。本文主要研究內(nèi)容如下：
　　 一、根據(jù)GenBank中小鼠IL-33基因序列(No. AY905582)設(shè)計特異性引物，用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)，克隆出IL-33基因的全長編碼區(qū)。將其克隆入pcDNA3.1(+)載體，構(gòu)建其真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-mIL-33，之后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌TOP10中，經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定及序列測序，得知它與GenBank中的序列完全一致，為IL-33基

4、因的表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、根據(jù)小鼠IL-33基因序列設(shè)計特異性引物，用PCR 技術(shù)，克隆出IL-33 成熟蛋白編碼區(qū)，將其克隆入載體pET-44，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-44-mIL-33，經(jīng)測序鑒定其編碼基因與GenBank中的序列一致。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中獲得表達(dá)菌株，然后在25°C 用IPTG 誘導(dǎo)，表達(dá)的融合蛋白以可溶性蛋白及包涵體形式存在。用鎳離子親和層析法純化以可溶性形式存在的目的

5、蛋白，經(jīng)凝膠圖像分析確定其純度可高達(dá)95%以上。
　　 細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，重組IL-33 蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的活性，且其活性比標(biāo)準(zhǔn)品高。
　　 三、利用純化的IL-33 蛋白，免疫新西蘭白兔，制備兔抗小鼠IL-33 多克隆抗體，ELISA結(jié)果顯示，該多克隆抗體效價高達(dá)1:32 000 ；Western blot 結(jié)果顯示，該多克隆抗體可以與小鼠IL-33 蛋白特異性結(jié)合。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，小鼠IL-33 蛋