淇河鯽穿孔素基因的克隆與表達研究.pdf

1、穿孔素(poreformingprotein，PFP)是由細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)和自然殺傷細胞(naturalkillercell，NK)分泌的一種具有很強溶胞活性的細胞毒蛋白，PFP不僅是一種重要的免疫效應分子，還是一種免疫調節(jié)分子。由PFP介導的細胞毒作用是CTL清除病毒感染和變異細胞的主要作用機制。本研究對淇河鯽(CarassiusauratusinQiheriver)的PFP基因進行

2、了克隆鑒定，并使用RT-PCR和Q-PCR技術檢測了淇河鯽的PFP基因在不同組織中以及早期發(fā)育階段基因的表達，使用Q-PCR技術對淇河鯽在誘導劑誘導和病原脅迫下PFP基因的表達進行了分析。
　　使用簡并引物擴增獲得淇河鯽的兩個PFP基因的中間片段，使用RACE法擴增得到PFP基因cDNA全長。淇河鯽PFP-1基因cDNA全長為2151bp，其中，5'-非翻譯區(qū)(UTR)119bp和3'-UTR346bp，ORF為1686bp，編碼

3、561個氨基酸。PFP-1蛋白的分子量約為63.304kDa，pI為9.07;淇河鯽PFP-2基因的cDNA序列全長為2047bp，5'-UTR177bp和3'-UTR196bp，ORF為1674bp，編碼557個氨基酸。PFP-2蛋白的分子量約為60.997kDa，pI為9.28。結構預測顯示，PFP-1和PFP-2都含有MACPF和C2等保守結構域。PFP-1還存在有一個富含絲氨酸的SER-RICH結構區(qū)域，而PFP-2則擁有一個特

4、殊的CXCXC半胱氨酸結基序。TMHMM軟件分析，PFP-1和PFP-2都沒有跨膜螺旋。
　　RT-PCR以及Q-PCR結果顯示，淇河鯽PFP-1和PFP-2轉錄本在所取的12個組織中以及早期發(fā)育階段均有表達，且在不同組織中，基因的表達量具有一定的差異性。PFP-1基因在肌肉中的表達量最高，而在心臟和卵巢中的表達量最低;PFP-2基因在鰓中的表達量最高，而在卵巢中的表達量最低。
　　PFP-1與PFP-2在淇河鯽的早期發(fā)育階

5、段的表達變化存在一定的差異。PFP-1基因的表達量從成熟的卵細胞開始到處于心跳期的受精卵，呈先降后升的趨勢，在初孵仔魚出現(xiàn)短暫回落之后又持續(xù)上調并穩(wěn)定表達;從成熟的卵細胞、處于細胞分裂期的受精卵至胚孔封閉期，PFP-1基因的表達量持續(xù)下調并達到最低，與成熟的卵細胞相比，PFP-1基因的表達量下降約46倍，之后又呈現(xiàn)穩(wěn)步上調的趨勢;PFP-2基因的表達量從成熟的卵細胞開始到晶體出現(xiàn)期，呈先升后降的趨勢，之后表達量持續(xù)上調至出膜第10d達到

6、第二個高峰期，再逐漸下調并趨于穩(wěn)定。PFP-2基因從成熟的卵細胞到桑葚期，表達量持續(xù)上調并達到最高，表達量約上調24倍，之后至晶體出現(xiàn)期，基因表達量持續(xù)下調并達到最低，與桑葚期相比，約下調125倍，之后至出膜第10d，表達量持續(xù)穩(wěn)定的增加，從出膜第10d至30d，PFP-2基因表達量又略微下調并趨于穩(wěn)定。在早期發(fā)育階段，推測穿孔素在保護胚胎的正常發(fā)育以及仔魚的非特異性免疫方面發(fā)揮著重要作用。
　　淇河鯽經PolyI∶C、PHA兩種

7、誘導物刺激后，PFP-1基因在血液和脾臟中的表達量都呈先升后降的趨勢，而在頭腎中的表達變化無明顯規(guī)律。PHA誘導后PFP-1和PFP-2基因在肝臟中的表達則呈持續(xù)下調的趨勢;而經PolyI∶C誘導后，PFP-1和PFP-2基因在脾臟、肝臟中的表達變化則存在很大的差異。
　　嗜水氣單胞菌急性脅迫淇河鯽6h時，PFP-1基因在肝臟、脾臟、腎臟、血液、腸道和鰓六個組織中的表達量均下調，以脾臟中的表達量下調最為顯著;PFP-2基因在鰓、脾