淇河鯽穿孔素基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、穿孔素(poreformingprotein，PFP)是由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxiclymphocyte，CTL)和自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell，NK)分泌的一種具有很強(qiáng)溶胞活性的細(xì)胞毒蛋白，PFP不僅是一種重要的免疫效應(yīng)分子，還是一種免疫調(diào)節(jié)分子。由PFP介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用是CTL清除病毒感染和變異細(xì)胞的主要作用機(jī)制。本研究對淇河鯽(CarassiusauratusinQiheriver)的PFP基因進(jìn)行

2、了克隆鑒定，并使用RT-PCR和Q-PCR技術(shù)檢測了淇河鯽的PFP基因在不同組織中以及早期發(fā)育階段基因的表達(dá)，使用Q-PCR技術(shù)對淇河鯽在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)和病原脅迫下PFP基因的表達(dá)進(jìn)行了分析。
　　使用簡并引物擴(kuò)增獲得淇河鯽的兩個(gè)PFP基因的中間片段，使用RACE法擴(kuò)增得到PFP基因cDNA全長。淇河鯽PFP-1基因cDNA全長為2151bp，其中，5'-非翻譯區(qū)(UTR)119bp和3'-UTR346bp，ORF為1686bp，編碼

3、561個(gè)氨基酸。PFP-1蛋白的分子量約為63.304kDa，pI為9.07;淇河鯽PFP-2基因的cDNA序列全長為2047bp，5'-UTR177bp和3'-UTR196bp，ORF為1674bp，編碼557個(gè)氨基酸。PFP-2蛋白的分子量約為60.997kDa，pI為9.28。結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，PFP-1和PFP-2都含有MACPF和C2等保守結(jié)構(gòu)域。PFP-1還存在有一個(gè)富含絲氨酸的SER-RICH結(jié)構(gòu)區(qū)域，而PFP-2則擁有一個(gè)特

4、殊的CXCXC半胱氨酸結(jié)基序。TMHMM軟件分析，PFP-1和PFP-2都沒有跨膜螺旋。
　　RT-PCR以及Q-PCR結(jié)果顯示，淇河鯽PFP-1和PFP-2轉(zhuǎn)錄本在所取的12個(gè)組織中以及早期發(fā)育階段均有表達(dá)，且在不同組織中，基因的表達(dá)量具有一定的差異性。PFP-1基因在肌肉中的表達(dá)量最高，而在心臟和卵巢中的表達(dá)量最低;PFP-2基因在鰓中的表達(dá)量最高，而在卵巢中的表達(dá)量最低。
　　PFP-1與PFP-2在淇河鯽的早期發(fā)育階

5、段的表達(dá)變化存在一定的差異。PFP-1基因的表達(dá)量從成熟的卵細(xì)胞開始到處于心跳期的受精卵，呈先降后升的趨勢，在初孵仔魚出現(xiàn)短暫回落之后又持續(xù)上調(diào)并穩(wěn)定表達(dá);從成熟的卵細(xì)胞、處于細(xì)胞分裂期的受精卵至胚孔封閉期，PFP-1基因的表達(dá)量持續(xù)下調(diào)并達(dá)到最低，與成熟的卵細(xì)胞相比，PFP-1基因的表達(dá)量下降約46倍，之后又呈現(xiàn)穩(wěn)步上調(diào)的趨勢;PFP-2基因的表達(dá)量從成熟的卵細(xì)胞開始到晶體出現(xiàn)期，呈先升后降的趨勢，之后表達(dá)量持續(xù)上調(diào)至出膜第10d達(dá)到

6、第二個(gè)高峰期，再逐漸下調(diào)并趨于穩(wěn)定。PFP-2基因從成熟的卵細(xì)胞到桑葚期，表達(dá)量持續(xù)上調(diào)并達(dá)到最高，表達(dá)量約上調(diào)24倍，之后至晶體出現(xiàn)期，基因表達(dá)量持續(xù)下調(diào)并達(dá)到最低，與桑葚期相比，約下調(diào)125倍，之后至出膜第10d，表達(dá)量持續(xù)穩(wěn)定的增加，從出膜第10d至30d，PFP-2基因表達(dá)量又略微下調(diào)并趨于穩(wěn)定。在早期發(fā)育階段，推測穿孔素在保護(hù)胚胎的正常發(fā)育以及仔魚的非特異性免疫方面發(fā)揮著重要作用。
　　淇河鯽經(jīng)PolyI∶C、PHA兩種

7、誘導(dǎo)物刺激后，PFP-1基因在血液和脾臟中的表達(dá)量都呈先升后降的趨勢，而在頭腎中的表達(dá)變化無明顯規(guī)律。PHA誘導(dǎo)后PFP-1和PFP-2基因在肝臟中的表達(dá)則呈持續(xù)下調(diào)的趨勢;而經(jīng)PolyI∶C誘導(dǎo)后，PFP-1和PFP-2基因在脾臟、肝臟中的表達(dá)變化則存在很大的差異。
　　嗜水氣單胞菌急性脅迫淇河鯽6h時(shí)，PFP-1基因在肝臟、脾臟、腎臟、血液、腸道和鰓六個(gè)組織中的表達(dá)量均下調(diào)，以脾臟中的表達(dá)量下調(diào)最為顯著;PFP-2基因在鰓、脾