孤雌生殖鹵蟲(chóng)卵母細(xì)胞中休眠卵發(fā)育相關(guān)基因的分離分析.pdf

1、鹵蟲(chóng)(Artemia)，也叫鹽水豐年蝦(Brine Shrimp)，屬于節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、鰓足亞綱(Branchiopoda)、無(wú)甲目( Anostacea)、鹵蟲(chóng)科(Artemidae)、鹵蟲(chóng)屬(Ar temia)，廣泛分布于內(nèi)陸鹽湖中。鹵蟲(chóng)是目前已知耐鹽范圍最寬的多細(xì)胞動(dòng)物。鹵蟲(chóng)的胚胎具有兩種發(fā)育方式：一種是卵生( oviparity)，產(chǎn)生休眠卵(diapause cyst)，此時(shí)胚

2、胎停滯在原腸胚時(shí)期，休眠胚胎被厚厚的外殼包被，具有極低的代謝活性和很強(qiáng)的抗逆性，只有經(jīng)歷特殊的環(huán)境條件才能繼續(xù)發(fā)育；另一種是卵胎生(ovoviviparity)，直接產(chǎn)生無(wú)節(jié)幼體(nauplius)或先產(chǎn)生有薄外殼包被的卵并發(fā)育成無(wú)節(jié)幼體。
　　 為了探索鹵蟲(chóng)休眠生殖發(fā)育方式調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，我們運(yùn)用消減雜交方法從鹵蟲(chóng)(Artemia parthenogenetica，尕海湖)的將要經(jīng)歷休眠生殖方式的卵母細(xì)胞中克隆了大量基因的cD

3、NA.主要研究結(jié)果可以分為以下三部分：1)、為了開(kāi)發(fā)全長(zhǎng)cDNA消減雜交技術(shù)，我們首先改進(jìn)了一種基于PCR的雙鏈cDNA合成方法，使合成的雙鏈cDNA中全長(zhǎng)cDNA的比例增加，同時(shí)系統(tǒng)分析了PCR抑制性作用(PCR-suppression effect，PS-effect)的各影響因素，并利用PS-effect對(duì)小分子抑制作用更強(qiáng)的特點(diǎn)選擇性的富集雙鏈cDNA中大分子；2)、開(kāi)發(fā)了雙鏈特異性DNA酶介導(dǎo)的cDNA均一化消減雜交(Dupl

4、ex-specific nuclease-mediated normalization andsubtractive hybridization，DNSH)，模型實(shí)驗(yàn)表明該方法能夠使只占mRNA總含量0.0001％的差異表達(dá)的基因能夠被有效富集，并且能夠得到其全長(zhǎng)cDNA；3)、運(yùn)用DNSH，使將要卵胎生的鹵蟲(chóng)卵母細(xì)胞去消減將要卵生的卵母細(xì)胞，分離并分析了將要產(chǎn)休眠卵鹵蟲(chóng)側(cè)囊中卵母細(xì)胞的692個(gè)cDNA克隆，其中有323個(gè)與GenBan

5、k上已有的序列具有相似性。這692個(gè)cDNA共組裝成600個(gè)cDNA重疊群(contig)，其中單一的(singleton)有529，占了大部分。我們選擇了其中44個(gè)功能各異的基因(來(lái)源于56個(gè)克隆)進(jìn)行熒光定量PCR分析，它們之間的mRNA水平差異最大達(dá)到約15，000倍。這其中，11個(gè)基因(21個(gè)克隆)的表達(dá)量在將產(chǎn)休眠卵的鹵蟲(chóng)卵母細(xì)胞中顯著性上調(diào)(p<0.05)，另有7個(gè)基因(9個(gè)克隆)的表達(dá)量顯著性下調(diào)(p<0.05).由此表明