家蠅幼蟲粉作為飼料添加劑在鯽魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用.pdf

1、一、研究背景和目的:
　　 在資源昆蟲中，家蠅（Musca domestica）的研究和開發(fā)利用一直受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視。家蠅幼蟲（蛆）除含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有甲殼素、抗菌肽、凝集素、溶菌酶等生物活性物質(zhì)，在生物醫(yī)藥、食品和飼料開發(fā)等方面有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。在畜禽和水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖研究中，因家蠅幼蟲的蛋白質(zhì)含量較高，一般認(rèn)為它是魚粉的優(yōu)質(zhì)替代物，可作為飼料蛋白質(zhì)源組分。也有研究認(rèn)為，蠅蛆所含有的優(yōu)

2、質(zhì)脂肪、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和抗菌肽、凝集素等生物活性物質(zhì)具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力的作用。
　　 相對(duì)于其它幾種活性成分，甲殼素在家蠅幼蟲蛆殼中的含量較高，可達(dá)20％-30％。蠅蛆中的甲殼素以蛋白聚糖的形式存在，并伴生著碳酸鈣，直接添加于飼料中難以被消化，沒有營(yíng)養(yǎng)作用，有研究認(rèn)為蠅蛆中的甲殼素可機(jī)械性地阻礙腸道吸收蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，影響動(dòng)物的消化和吸收功能。作為一種新型的飼料酶制劑，甲殼素酶可降解甲殼素為水

3、溶性寡糖，消除其抗?fàn)I養(yǎng)因子作用，甲殼素寡糖的生物活性與甲殼素類似或更高，既可作為一種免疫增強(qiáng)劑也可作為一種營(yíng)養(yǎng)性多糖利用。因此，可以把甲殼素酶作為一種消除抗?fàn)I養(yǎng)因子的飼料酶制劑添加于含蠅蛆組分的飼料中，降解其中的不溶性甲殼素以提高動(dòng)物對(duì)其它營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用。
　　 目前，通過(guò)基因重組技術(shù)將特定酶基因轉(zhuǎn)移到適宜宿主菌內(nèi)發(fā)酵已成為生產(chǎn)飼料酶的有效途徑。作為一種新的蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)，酵母表面展示系統(tǒng)可以把各種生物活性酶表達(dá)并固定于細(xì)

4、胞表面，產(chǎn)生具有活性的酵母全細(xì)胞酶，而利用全細(xì)胞酶作為飼料添加劑可避免胞外表達(dá)飼料酶制劑生產(chǎn)過(guò)程中的純化和載體吸附等繁瑣的下游程序。因此，為了消除家蠅幼蟲中甲殼素的抗?fàn)I養(yǎng)因子作用，充分發(fā)揮其生物活性，本課題利用公認(rèn)安全的釀酒酵母作為表達(dá)宿主，在其表面展示一種耐熱甲殼素酶，制備出具甲殼素降解活性的全細(xì)胞酶，通過(guò)鯽魚養(yǎng)殖試驗(yàn)評(píng)價(jià)其作為飼料酶添加劑降解蠅蛆中甲殼素后對(duì)鯽魚生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力的影響，以期研制出一種具有消除甲殼素抗?fàn)I養(yǎng)因子

5、作用并可促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、增強(qiáng)動(dòng)物免疫力的飼料酶制劑，同時(shí)進(jìn)一步提高家蠅蛆粉作為飼料添加劑的利用價(jià)值。
　　 論文包括五個(gè)部分:
　　 (1)序言（研究背景、目的和思路）
　　 (2)蠅蛆常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析及所含甲殼素的提取與制備
　　 (3)蠅蛆粉對(duì)鯽魚的生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力的影響
　　 (4)利用酵母表面展示技術(shù)研制一種具甲殼素降解活性的熱穩(wěn)定的全細(xì)胞酶
　　 (5)酵母酶作用于家蠅蛆

6、粉后對(duì)鯽魚的生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力的影響
　　 二、研究方法:
　　 在對(duì)家蠅蛆粉的主要營(yíng)養(yǎng)成分（水分、蛋白質(zhì)和脂肪）含量進(jìn)行測(cè)定的基礎(chǔ)上，用蠅蛆粉按不同比例取代魚粉對(duì)鯽魚進(jìn)行12周飼養(yǎng)試驗(yàn)，觀察蠅蛆粉對(duì)鯽魚生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力的影響。在綜合分析上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，針對(duì)蠅蛆粉中具有的甲殼素可能作為一種影響動(dòng)物攝食和消化的抗?fàn)I養(yǎng)因子的情況，研制一種表面展示甲殼素酶的全細(xì)胞酵母酶作為降解抗?fàn)I養(yǎng)因子的飼料酶制劑，并

7、按不同比例添加于含有蠅蛆粉的飼料中，對(duì)鯽魚進(jìn)行12周飼養(yǎng)試驗(yàn)，觀察添加酵母酶作用于蠅蛆粉中的甲殼素后對(duì)鯽魚生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力的影響。
　　 具體研究方法如下:
　　 1.采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分別測(cè)定魚粉和蠅蛆粉的水分、蛋白質(zhì)和脂肪含量;采用酸堿法和微波加熱法提取蠅蛆殼中的甲殼素。
　　 2.按照試驗(yàn)要求選擇96尾魚苗，隨機(jī)分為4組，每組24尾，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8尾，其中，第1組為對(duì)照

8、組，投喂基礎(chǔ)飼料;其它3組為試驗(yàn)組，分別投喂含蠅蛆粉為5％、10％和15％的試驗(yàn)飼料，進(jìn)行12周養(yǎng)殖試驗(yàn)，觀察蠅蛆粉對(duì)鯽魚生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力的影響:
　　 (1)通過(guò)魚體的初始、終末體重和飼料消耗量計(jì)算各生長(zhǎng)指標(biāo)（體重增加、相對(duì)增重率、特異生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)），統(tǒng)計(jì)成活率。
　　 (2)采用稀釋法計(jì)數(shù)鯽魚單位容積內(nèi)的紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)，采用Wright-Giemsa復(fù)合染色法進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。
　　 (3)

9、應(yīng)用硝基四氮唑藍(lán)還原法檢測(cè)血液中嗜中性粒細(xì)胞的殺菌功能;以酵母多糖刺激法和硝基四氮唑藍(lán)還原法檢測(cè)白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性。
　　 (4)分別采用比濁法、黃嘌呤氧化酶法和鐵還原能力測(cè)定法測(cè)定血清和肝胰臟中的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力。
　　 (5)分別采用碘-淀粉比色法、精氨酸乙酯法檢測(cè)腸和肝胰臟中的淀粉酶和胰蛋白酶活性。
　　 (6)測(cè)定鯽魚的含肉率;采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分別測(cè)定鯽魚

10、肌肉的水分、蛋白質(zhì)和脂肪含量。
　　 3.利用酵母表面展示技術(shù)研制一種熱穩(wěn)定的具甲殼素降解活性的全細(xì)胞酶
　　 (1)根據(jù)GenBank公布的粘質(zhì)沙雷氏菌甲殼素酶C基因(Serratia marcescensChiC)編碼序列設(shè)計(jì)引物，從粘質(zhì)沙雷氏菌基因組DNA中克隆出ChiC基因，經(jīng)測(cè)序鑒定和生物信息學(xué)分析后構(gòu)建表面展示載體pYD1-SMChiC，利用a-凝集素受體系統(tǒng)把SMChiC錨定于酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁，構(gòu)建具有甲殼

11、素降解功能的酵母細(xì)胞，并采用Western blot對(duì)純化的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，采用細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)目的蛋白在細(xì)胞表面的錨定情況。
　　 (2)優(yōu)化釀酒酵母表面展示SMChiC的表達(dá)條件，采用SDS-PAGE酶譜法鑒定純化酶的甲殼素降解活性，采用瓊脂平板培養(yǎng)法和二硝基水楊酸比色法對(duì)酵母細(xì)胞的甲殼素降解活性進(jìn)行定性和定量測(cè)定。
　　 (3)測(cè)試溫度和pH對(duì)酵母細(xì)胞或純化產(chǎn)物的甲殼素降解活性的影響。
　　 4.按照

12、試驗(yàn)要求選擇96尾魚苗，隨機(jī)分為4組，每組24尾，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8尾，其中，第1組為對(duì)照組，投喂基礎(chǔ)飼料;其他3組為試驗(yàn)組，分別投喂含酵母酶為0.5％、1.0％和1.5％的試驗(yàn)飼料，進(jìn)行12周養(yǎng)殖試驗(yàn)，觀察酵母酶作用于蠅蛆粉中的甲殼素后對(duì)鯽魚生長(zhǎng)性能和非特異性免疫能力的影響:
　　 (1)通過(guò)魚體的初始、終末體重和飼料消耗量計(jì)算各生長(zhǎng)指標(biāo)（體重增加、相對(duì)增重率、特異生長(zhǎng)率和飼料系數(shù)），統(tǒng)計(jì)成活率。
　　 (2)采

13、用稀釋法計(jì)數(shù)鯽魚單位容積內(nèi)的紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)，采用Wright-Giemsa復(fù)合染色法進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。
　　 (3)應(yīng)用硝基四氮唑藍(lán)還原法檢測(cè)血液中嗜中性粒細(xì)胞的殺菌功能;以酵母多糖刺激法和硝基四氮唑藍(lán)還原法檢測(cè)白細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活性。
　　 (4)分別采用比濁法、黃嘌呤氧化酶法和鐵還原能力測(cè)定法測(cè)定血清和肝胰臟中的溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力。
　　 (5)分別采用碘-淀粉比色法、精氨酸乙酯法

14、檢測(cè)腸和肝胰臟中的淀粉酶和胰蛋白酶活性。
　　 (6)測(cè)定鯽魚的含肉率;采用直接干燥法、分光光度法和酸水解法分別測(cè)定鯽魚肌肉的水分、粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量。
　　 (7)采集鯽魚肝胰臟、脾臟、腎臟、腸樣本制片并進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，觀察酵母酶對(duì)鯽魚組織結(jié)構(gòu)的影響。
　　 4.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差((x)±sd)表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。其中，蠅蛆粉和魚粉的蛋白質(zhì)含量采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，

15、P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=3)。鯽魚的生長(zhǎng)指標(biāo)、各類血細(xì)胞比例或含量、NBT還原能力和呼吸爆發(fā)活性、相關(guān)酶的活性和總抗氧化能力、肌肉含肉率及主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量等指標(biāo)(n=3)的組間比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，滿足方差齊性和方差分析顯著的情況下，采用Bonferroni法進(jìn)行組間差異的多重比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 三、研究結(jié)果:
　　 1.對(duì)家蠅蛆粉和魚粉的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)

16、定結(jié)果:蛋白質(zhì)含量分別為61.51±1.08％和60.32±1.10％，蠅蛆粉和魚粉之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.337，P=0.252）。水分分別為6.95±0.11％和8.74±0.13％;脂肪含量分別為13.71±0.13％和7.32±0.11％。以蠅蛆殼提取的甲殼素占干殼重的27.62±0.26％。
　　 2.用蠅蛆粉按不同比例取代魚粉對(duì)鯽魚進(jìn)行12周喂養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示:
　　 (1)鯽魚的體重增加（F=7.7

17、35，P=0.009）、相對(duì)增重率（F=7.143，P=0.012）、特定生長(zhǎng)率（F=7.141，P=0.012）和飼料系數(shù)（F=7.208，P=0.012）在四組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10％蠅蛆粉組的上述各指標(biāo)效果與對(duì)照組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（對(duì)應(yīng)的P值分別為0.009、0.012、0.012和0.012）;5％蠅蛆粉組（對(duì)應(yīng)的P值分別為0.261、0.349、0.353和0.184）和15％蠅蛆粉組（對(duì)應(yīng)的P值分別為0.06

18、9、0.099、0.094和0.063）和對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (2)鯽魚的白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性（F=53.138，P＜0.001）、嗜中性粒細(xì)胞的吞噬功能(F=17.817，P=0.001)、血清SOD酶活性(F=10.593，P=0.004)、肝胰臟SOD酶活性(F=4.972，P=0.031)、血清總抗氧化能力（F=9.042，P=0.006）、肝胰臟總抗氧化能力（F=9.343，P=0.005）在四組間的差

19、異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，以10％蠅蛆粉組的上述各種指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組（P值分別為0.001、0.001、0.004、0.046、0.015和0.006）;鯽魚血清中溶菌酶活性有增強(qiáng)的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.118，P=0.947）。
　　 (3)中性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)（F=0.612，P=0.626）、嗜堿性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)（F=0.225，P=0.876）、淋巴細(xì)胞分?jǐn)?shù)（F=0.387，P=0.766）、單核細(xì)胞分?jǐn)?shù)（F=0.

20、409，P=0.751）、紅細(xì)胞含量(F=0.354，P=0.788)和白細(xì)胞含量(F=0.248，P=0.861)在四組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (4)腸組織淀粉酶活性（F=0.273，P=0.844）、肝胰臟淀粉酶活性（F=1.698，P=0.244）、腸組織胰蛋白酶活性（F=1.815，P=0.222）和肝胰臟胰蛋白酶活性(F=3.301，P=0.079)在四組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (5)鯽魚含肉率（F

21、=3.272，P=0.080）、肌肉的水分（F=0.284，P=0.836）、蛋白質(zhì)含量（干重％）（F=1.714，P=0.241）和脂肪含量（干重％）（F=0.026，P=0.994）在四組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.從Serratia marcescens AS1.1652菌株基因組中擴(kuò)增得到了ChiC基因編碼序列，測(cè)序結(jié)果分析表明，AS1.1652 ChiC基因含有1443bp，推導(dǎo)的Serratia marcesc

22、ensAS1.1652 chitinase C含有480個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)該蛋白的等電點(diǎn)為5.36，分子量約為52kD，且該蛋白不含信號(hào)肽。Serratia marcescens AS1.1652 chitinase C和其他菌株（stain2170，strain141，strain xd1，stain BJL200）在DNA水平上的相似性分別為96％、96％、96％、98％;在蛋白質(zhì)水平上的相似性分別為99％、98％、98％、99％。構(gòu)建

23、的酵母表面展示質(zhì)粒pYD1-SMChiC中，ChiC基因通過(guò)(Gly4-Ser)3 Linker編碼序列融合于Aga2 gene的C端，C端V5表位或6×His標(biāo)簽可用于融合蛋白質(zhì)的檢測(cè)。
　　 4.經(jīng)免疫熒光染色鑒定，證實(shí)甲殼素酶已經(jīng)表達(dá)并固定于釀酒酵母細(xì)胞表面。表達(dá)產(chǎn)物（Aga2-SMChiC融合蛋白）經(jīng)Western Blot鑒定，大小約67kD;應(yīng)用瓊脂平板法和SDS-PAGE酶譜法檢測(cè)證實(shí)甲殼素酶在酵母中成功表達(dá)，且對(duì)

24、α-型和β-型甲殼素均具降解活性。對(duì)甲殼素酶的表達(dá)和展示條件進(jìn)行了優(yōu)化，其最佳誘導(dǎo)時(shí)間、溫度和pH分別為72h、22℃和6.0。
　　 5.酵母酶在20℃-80℃之間均具有甲殼素降解活性，在80℃仍然能夠檢測(cè)到初始活性的9％，其最適反應(yīng)溫度為52℃。熱穩(wěn)定性測(cè)試表明，70℃處理4h后酵母酶保留其初始活性的88.6％，把酶煮沸1h后其活性仍然保留一定活性，純化酶的酶譜檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)在一定高溫下酶具有熱穩(wěn)定性。酵母酶在pH2.2-8

25、.0條件下均可顯示活性，最適pH為5.0，在酸性條件下，全細(xì)胞酵母酶保持一定的穩(wěn)定性。
　　 6.以不同比例的酵母酶添加于含10％蠅蛆粉的飼料中，對(duì)鯽魚進(jìn)行12周喂養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示:
　　 (1)鯽魚的體重增加(F=37.289，P＜0.001)、相對(duì)增重率(F=33.053，P＜0.001)、特定生長(zhǎng)率（F=31.435，P＜0.001）和飼料系數(shù)(F=47.163，P＜0.001)在四組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.

26、5％酵母酶組(P值分別為0.004、0.006、0.008、0.001)、1.0％酵母酶組（P值分別為0.001、＜0.001、＜0.001、＜0.001）、1.5％酵母酶組（P值分別為0.001、0.003、0.003、＜0.001）的體重增加、相對(duì)增重率和特定生長(zhǎng)率均顯著高于對(duì)照組，而飼料系數(shù)均顯著低于對(duì)照組。
　　 (2)鯽魚的嗜中性粒細(xì)胞吞噬功能（F=36.935，P＜0.001）和白細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性（F=96.737，

27、P＜0.001）在四組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。0.5％酵母酶組（P值分別為0.014、＜0.001）、1.0％酵母酶組（P值分別為＜0.001、＜0.001）、1.5％酵母酶組（P值分別為0.037、＜0.001）的上述指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組。
　　 (3)鯽魚血清中的溶菌酶活力（F=34.057，P＜0.001）、SOD酶活力(F=33.490，P＜0.001)、總抗氧化能力（F=20.579，P＜0.001）和肝胰臟中的溶菌

28、酶活力（F=35.497，P＜0.001）、SOD酶活力（F=16.673，P=0.001）、總抗氧化能力(F=24.374，P＜0.001)在四組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，0.5％酵母酶組（P值分別為0.001、0.001、0.002、＜0.001）、1.0％酵母酶組（P值分別為0.001、P＜0.001、0.001、＜0.001）、1.5％酵母酶組(P值分別為0.001、0.001、0.001、＜0.001)的血清溶菌酶活性、

29、SOD酶活性、總抗氧化能力和肝胰臟溶菌酶活性均顯著高于對(duì)照組。1.0％酵母酶組的肝胰臟SOD酶活性顯著高于對(duì)照組(P=0.001)。1.0％酵母酶組(P＜0.001)和1.5％酵母酶組(P=0.004)肝胰臟勻漿中的總抗氧化能力顯著高于對(duì)照組。
　　 (4)中性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)（F=1.590，P=0.266）、嗜堿性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)（F=0.277，P=0.875）、淋巴細(xì)胞分?jǐn)?shù)（F=0.877，P=0.492）、單核細(xì)胞分?jǐn)?shù)（F=1.9

30、23，P=0.204）、紅細(xì)胞含量(F=0.344，P=0.795)和白細(xì)胞含量（F=0.061，P=0.979）在四組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (5)腸組織淀粉酶活性（F=0.240，P=0.866）、肝胰臟淀粉酶活性（F=1.285，P=0.344）、腸組織胰蛋白酶活性（F=1.110，P=0.400）和肝胰臟胰蛋白酶活性（F=2.043，P=0.187）在四組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (6)鯽魚含肉率（F=

31、0.478，P=0.706）、肌肉的水分（F=1.706，P=0.243）、蛋白質(zhì)含量（干重％）（F=0.016，P=0.997）和脂肪含量（干重％）（F=0.076，P=0.971）在四組間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 (7)病理切片鏡檢結(jié)果表明各酵母酶組飼養(yǎng)鯽魚主要臟器器官未見異常改變，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未對(duì)鯽魚臟器造成不良影響。
　　 四、結(jié)論:
　　 蠅蛆粉和魚粉的蛋白質(zhì)含量相近，但蠅蛆殼中含有的甲殼素不溶于水，可

32、能具有抗?fàn)I養(yǎng)因子作用。蠅蛆粉部分取代魚粉能促進(jìn)鯽魚生長(zhǎng)，提高飼料利用效率，增強(qiáng)鯽魚白細(xì)胞吞噬功能和呼吸爆發(fā)能力，并可增強(qiáng)魚體抗氧化能力，從而增強(qiáng)其非特異性免疫功能，且對(duì)魚肉品質(zhì)無(wú)不良影響。結(jié)果表明蠅蛆粉可以部分取代魚粉作為優(yōu)質(zhì)的飼料蛋白質(zhì)源。
　　 表面展示SerratiamarcescensChiC的釀酒酵母全細(xì)胞具有甲殼素降解活性，是一種具有熱穩(wěn)定性的耐高溫酶，且在較低pH條件仍保持一定的穩(wěn)定性。具有甲殼素降解活性的酵母酶可