小麥穎果與根部中Cathepsin B-like蛋白功能的初步研究.pdf

1、細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)指在生物的生長發(fā)育過程中，由自身基因編碼的、主動(dòng)和有序的細(xì)胞死亡過程，是生物體自身新陳代謝和發(fā)育的正常生理反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)，小麥韌皮部篩分子(sieve elements，SEs)的發(fā)育經(jīng)歷了一個(gè)程序性細(xì)胞半死亡(programmed cell semi-death)過程;同時(shí)，包括植物根冠、小麥穎果內(nèi)糊粉層等多處部位在內(nèi)的組織細(xì)胞也均被證明發(fā)生了PCD。這些

2、細(xì)胞的PCD過程均發(fā)生在相應(yīng)組織的發(fā)育階段，與發(fā)育過程的推進(jìn)密切相關(guān)，那么這些不同組織的PCD過程之間是否存在著相關(guān)的調(diào)控機(jī)理和相似的作用因子呢？這是本研究試圖解決的問題。
　　 本研究以小麥(Triticum aestivum L.)品種華麥八號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料，利用熒光顯微鏡、免疫組織化學(xué)技術(shù)、活性原位熒光染色、分子生物學(xué)技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、金屬自顯影以及TSQ熒光探針檢測等方法，研究在小麥根尖與穎果發(fā)育過程中發(fā)生的PCD的調(diào)控過

3、程以及cathepsin B-like蛋白酶在這些過程中的作用。主要結(jié)果如下:
　　 1、熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著SEs的發(fā)育，細(xì)胞壁開始增厚，自發(fā)熒光的強(qiáng)度也相應(yīng)發(fā)生變化，這為我們研究SEs中cathepsin B-like蛋白的變化提供了時(shí)間上的參考。
　　 2、免疫組織化學(xué)檢測表明，距根尖頂端112μm處的根冠組織中，外緣1-3層細(xì)胞的cathepsin B-like蛋白陽性反應(yīng)強(qiáng)烈;在距根尖頂端約490-700μ

4、m處的組織中可以觀察到細(xì)胞內(nèi)陽性信號(hào)逐漸減弱，其中皮層中部薄壁細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)相對于外皮層和中柱細(xì)胞內(nèi)的陽性信號(hào)減弱速度較快;同時(shí)，隨著SEs與導(dǎo)管的發(fā)育，細(xì)胞內(nèi)cathepsin B-like蛋白的陽性信號(hào)也逐漸消失。
　　 3、活性原位熒光染色技術(shù)顯示根尖中的cathepsin B-like蛋白可以降解cathepsin B的特異性底物，并在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色陽性信號(hào)。RT-PCR結(jié)果顯示在根尖組織中有兩種cathepsin

5、B-like蛋白的mRNA積累:AI16和一個(gè)被命名為2529的蛋白。
　　 4、免疫電鏡結(jié)果顯示cathepsin B-like蛋白分布在發(fā)生PCD的細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，液泡中有零星分布。自噬小體中沒有觀察到cathepsin B-like蛋白的存在。
　　 5、金屬自顯影結(jié)果顯示在根尖細(xì)胞的核仁中有Zn2+存在。隨著組織的發(fā)育，SEs與木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞中的核仁和Zn2+逐漸消失。
　　 6、TSQ熒光探針標(biāo)

6、記顯示，外源Zn2+主要在根尖組織的中柱中積累，在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光，熒光強(qiáng)度隨著距根尖頂端距離的增加而減弱。
　　 7、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)加入ZnCl2濃度的提高，組織中表達(dá)cathepsin B-like蛋白的細(xì)胞數(shù)量有所下降，同時(shí)表達(dá)強(qiáng)度也有所降低。
　　 8.免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在小麥花后1天(1 DAF)到9天的穎果內(nèi)，cathepsinB-like蛋白的分布位置主要集中在灌漿池兩側(cè)維管

7、束以及內(nèi)果皮細(xì)胞中;花后12至24天的小麥穎果中，灌漿池兩側(cè)維管束細(xì)胞中的cathepsin B-like蛋白開始消失，同時(shí)穎果糊粉層內(nèi)的cathepsin B-like蛋白含量開始逐漸增加，而存在于穎果背部內(nèi)果皮細(xì)胞中的cathepsin B-like蛋白則出現(xiàn)含量下降，在細(xì)胞邊緣聚集等現(xiàn)象。
　　 以上結(jié)果說明在小麥發(fā)育過程的一些PCD過程中有共同的作用因子cathepsinB-like蛋白的參與;Cathepsin B-l