家蠶Perilipin-like蛋白的原核表達(dá)及功能研究.pdf

1、Perilipin蛋白是脂滴相關(guān)蛋白家族的核心成員之一，是定位于脂滴表面的高磷酸化的蛋白，對(duì)脂肪組織中甘油三酯的代謝有雙重調(diào)節(jié)作用，既可通過(guò)阻止脂肪酶接近脂滴降低基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂解，又可促進(jìn)激素刺激的脂肪分解。Perilipin蛋白在脂代謝中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)調(diào)控可能與肥胖及其相關(guān)代謝疾病如糖尿病、胰島素抵抗等有重要關(guān)系。從本實(shí)驗(yàn)室獲得一條cDNA，開(kāi)放閱讀框序列長(zhǎng)度為918bp的基因，預(yù)測(cè)其編碼的蛋白有305個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子量3

2、2.497kDa，經(jīng)NCBI比對(duì)發(fā)現(xiàn)，預(yù)測(cè)編碼的蛋白具有perilipin保守結(jié)構(gòu)域，將其命名為BmPLIN。將此基因插入到融合表達(dá)載體pET-28a(+)的多克隆位點(diǎn)，經(jīng)PCR，雙酶切鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta中，IPTG終濃度0 mM，37℃表達(dá)成功，表達(dá)的重組蛋白都以包涵體形式存在。經(jīng)過(guò)溶解液洗滌，將含有目的蛋白的上清經(jīng)鎳柱親和層析和反相柱層析純化后，以純化的重組蛋白為抗原免疫大白兔獲得該蛋白的多

3、克隆抗體，經(jīng)ELISA檢測(cè)，抗體效價(jià)可達(dá)1：12800以上。提取家蠶各個(gè)時(shí)期和組織的天然蛋白和總RNA，利用熒光定量PCR技術(shù)以及熒光Wester.blotting技術(shù)，分析BmPLIN基因在家蠶發(fā)育過(guò)程中不同時(shí)期及五齡幼蟲(chóng)各組織中的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)情況。結(jié)果顯示該基因mRNA在家蠶發(fā)育各時(shí)期的表達(dá)量由高到低依次為蛹、幼蟲(chóng)、卵、蛾，而在五齡幼蟲(chóng)各組織中，性腺中檢測(cè)到BmPLIN蛋白的表達(dá)。同時(shí)，以該抗體聯(lián)合免疫熒光標(biāo)記對(duì)家蠶Bm5細(xì)胞進(jìn)行亞細(xì)