家蠶Perilipin-like蛋白的原核表達及功能研究.pdf

1、Perilipin蛋白是脂滴相關蛋白家族的核心成員之一，是定位于脂滴表面的高磷酸化的蛋白，對脂肪組織中甘油三酯的代謝有雙重調節(jié)作用，既可通過阻止脂肪酶接近脂滴降低基礎狀態(tài)下的脂解，又可促進激素刺激的脂肪分解。Perilipin蛋白在脂代謝中發(fā)揮重要作用，其表達調控可能與肥胖及其相關代謝疾病如糖尿病、胰島素抵抗等有重要關系。從本實驗室獲得一條cDNA，開放閱讀框序列長度為918bp的基因，預測其編碼的蛋白有305個氨基酸殘基，相對分子量3

2、2.497kDa，經NCBI比對發(fā)現(xiàn)，預測編碼的蛋白具有perilipin保守結構域，將其命名為BmPLIN。將此基因插入到融合表達載體pET-28a(+)的多克隆位點，經PCR，雙酶切鑒定重組質粒構建成功后，將重組質粒轉化大腸桿菌Rosetta中，IPTG終濃度0 mM，37℃表達成功，表達的重組蛋白都以包涵體形式存在。經過溶解液洗滌，將含有目的蛋白的上清經鎳柱親和層析和反相柱層析純化后，以純化的重組蛋白為抗原免疫大白兔獲得該蛋白的多

3、克隆抗體，經ELISA檢測，抗體效價可達1：12800以上。提取家蠶各個時期和組織的天然蛋白和總RNA，利用熒光定量PCR技術以及熒光Wester.blotting技術，分析BmPLIN基因在家蠶發(fā)育過程中不同時期及五齡幼蟲各組織中的轉錄、表達情況。結果顯示該基因mRNA在家蠶發(fā)育各時期的表達量由高到低依次為蛹、幼蟲、卵、蛾，而在五齡幼蟲各組織中，性腺中檢測到BmPLIN蛋白的表達。同時，以該抗體聯(lián)合免疫熒光標記對家蠶Bm5細胞進行亞細