基因OLA1(Obg Like ATPase 1)的蛋白功能研究.pdf

1、研究背景：在真核細(xì)胞中，谷胱甘肽(Glutathione； GSH)是豐度最高的小分子肽。作為一種非常重要的非蛋白巰基分子，參與了一系列的細(xì)胞生理活動(dòng)：其作為一種還原劑和抗氧化劑，參與了大量的細(xì)胞外源性和內(nèi)源性分子的生理代謝；作為一種自由基清除劑，因?yàn)榛钚匝?ROS)和活性氮自由基(RNS)在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和許多病理發(fā)展過程中扮演了非常重要的角色，所以谷胱甘肽在含量與生理代謝上的改變被認(rèn)為和很多疾病有聯(lián)系，包括腫瘤，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，艾滋病，

2、衰老，囊性纖維化，肝病，心臟病，中風(fēng)，糖尿病以及營養(yǎng)不良癥。
　　 為了進(jìn)一步理解GSH的抗氧化調(diào)節(jié)及其對(duì)機(jī)體各種生理活動(dòng)的影響，數(shù)年以前，我們實(shí)驗(yàn)組成員施正政等人用遺傳學(xué)的方法在小鼠胚胎細(xì)胞中把谷氨酰半胱氨酸合成酶的重鏈基因敲除而得到自身不能合成GSH的小鼠胚胎，并把囊胚細(xì)胞分離出來進(jìn)行體外培養(yǎng)。這些突變型的囊胚細(xì)胞在含有GSH或者N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine；NAC)的培養(yǎng)基中能夠正常生長和無限繁殖，但

3、是當(dāng)GSH或者NAC沒有得到補(bǔ)充時(shí)，細(xì)胞都會(huì)死亡。用基因芯片的技術(shù)來研究GSH被剝奪之后突變型細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的變化，結(jié)果分析顯示有32個(gè)基因有顯著的差異表達(dá)。按照生物學(xué)功能分類，這些基因的功能包括細(xì)胞周期調(diào)控，細(xì)胞凋亡調(diào)控，生理代謝調(diào)控以及未知功能。OLAl(Obg-like ATPase； GTPBP9； PTD004)就是這32個(gè)基因中的一個(gè)，而且目前生理學(xué)功能未知。
　　 研究內(nèi)容：
　　 而本文將對(duì)這個(gè)未知功能的

4、基因-OLAl(Obg-like ATPase； GTPBP9； PTD004)進(jìn)行初步的研究，希望能了解該基因在細(xì)胞生理活動(dòng)中的功能，并進(jìn)一步理解該基因在GSH參與的細(xì)胞生長和抗氧化調(diào)節(jié)中的作用，從而增進(jìn)我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)和腫瘤發(fā)生發(fā)展的了解，為治療和預(yù)防腫瘤提供新的思路和方法。研究內(nèi)容共分三部分：(一)蛋白結(jié)構(gòu)，表達(dá)與功能分析；(二)調(diào)控抗氧化機(jī)制研究；(三)在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用。
　　 (一)蛋白結(jié)構(gòu)，表達(dá)與功能分

5、析
　　 我們通過生物信息學(xué)分析表明OLA1屬于Obg-類的GTPase家族，與P-IoopNTPase-YchF同源。其蛋白含有396個(gè)氨基酸，已知的結(jié)構(gòu)域有位于N端的Gdomain，其兩側(cè)有coiled-coil domain，還包括在C端的TGS domain。通過在GeneBank序列庫對(duì)比發(fā)現(xiàn)，OLAI基因和蛋白序列在酵母，小鼠和人類中的同源性極高，表明OLA1是相對(duì)保守的基因。我們用Westem blotting方法

6、在16中人類腫瘤和正常細(xì)胞系中檢測發(fā)現(xiàn)，OLAI是一個(gè)廣泛表達(dá)的基因，在多種腫瘤和正常細(xì)胞系中都有表達(dá)。我們通過免疫熒光的方法和在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染GFP融合表達(dá)質(zhì)粒，在熒光顯微鏡下觀察到OLAI蛋白定位在胞漿。
　　 (二)調(diào)控抗氧化機(jī)制研究
　　 首先我們用siRNA轉(zhuǎn)染的方法來降低其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，并用Westem blotting方法來檢測其knockdown的效果，在轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，與對(duì)照相比，knockdown細(xì)胞蛋

7、白水平下降80％以上。而且在用細(xì)胞計(jì)數(shù)，PI染色和Annexin V染色技術(shù)，發(fā)現(xiàn)knockdown細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖速率，死亡率和對(duì)照組細(xì)胞沒有差異。但是當(dāng)加入氧化劑包括diamide-巰基氧化劑和tert-butyl hydroperoxide(tBH)-過氧化劑處理5小時(shí)后，用MTS方法來檢查細(xì)胞活力時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組細(xì)胞由于氧化壓力的原因開始出現(xiàn)大量死亡，而knockdown細(xì)胞的死亡率卻比較低，仍能維持相對(duì)正常的生理活動(dòng)。另一方

8、面，當(dāng)我們用質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞使OLAI在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)后，過表達(dá)的細(xì)胞對(duì)這些氧化劑變得更敏感，更容易因氧化壓力而死亡。但是無論是OLA1低表達(dá)或過表達(dá)都沒有改變細(xì)胞對(duì)有線粒體毒性或DNA毒性的藥物的敏感性，包括antimycinA，etoposide，和doxorubincine，這說明OLA1對(duì)細(xì)胞的抗氧化能力的條件是有特異性的。
　　 當(dāng)我們用H2DCFDA染色并通過流式細(xì)胞技術(shù)來觀測細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平(ROS)，發(fā)現(xiàn)在加20

9、0μM tBH處理1小時(shí)，對(duì)照細(xì)胞中的ROS水平增加幅度顯著高于knockdown細(xì)胞(71.4％ vs.36％)，這表明OLA1-knockdown之后能抑制應(yīng)激產(chǎn)生的大量ROS。當(dāng)用bioluminescence-based assay來檢測細(xì)胞內(nèi)的GSH含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)在400μM tBH或者400μM diamide處理1小時(shí)，knockdown細(xì)胞內(nèi)的GSH含量仍能保持在相對(duì)較高的水平。同時(shí)，我們用基因芯片的方法來研究knockd

10、own之后細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的變化情況，結(jié)果顯示OLA1-knockdown所帶來的基因表達(dá)變化很小，在嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)學(xué)挑選條件下，共有13個(gè)基因發(fā)現(xiàn)表達(dá)有差異，而且目前的研究沒有發(fā)現(xiàn)這些基因和細(xì)胞抗氧化能力改變有直接的因果關(guān)系。而且當(dāng)加入20μg/ml cycloheximide后，細(xì)胞內(nèi)的蛋白合成被阻止，但MTS檢測細(xì)胞活力顯示，相比對(duì)照組細(xì)胞，knockdown細(xì)胞仍表現(xiàn)出對(duì)這些氧化劑具有較高的抵抗力.這有力說明OLAI作為細(xì)胞抗氧化反應(yīng)

11、的負(fù)調(diào)控因子，其作用機(jī)制是不依賴新的蛋白合成，而是對(duì)現(xiàn)存的蛋白的修飾，調(diào)節(jié)其功能來實(shí)現(xiàn)的。
　　 (三)在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲中的作用
　　 ROS作為信號(hào)傳導(dǎo)的中介，參與了腫瘤轉(zhuǎn)移的多個(gè)環(huán)節(jié)包括腫瘤細(xì)胞遷移和侵入。而OLA1對(duì)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平具有非常迅速的調(diào)節(jié)作用，所以很有可能通過調(diào)控ROS而參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)移這個(gè)過程。在“創(chuàng)傷.愈合”實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，knockdown細(xì)胞的遷移速率大約只有對(duì)照細(xì)胞的55％，具有遷移細(xì)胞特征的細(xì)胞

12、數(shù)目比例減少到42％，而對(duì)照組細(xì)胞占78％，表現(xiàn)出遷移受阻的現(xiàn)象。Cell migration assay和cell invasion assay顯示，在人類乳腺癌細(xì)胞MBA-MD-231中，OLA1被knockdown后，細(xì)胞的遷移和侵入被抑制，分別下降了43％和78％。而且同時(shí)knockdown細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激產(chǎn)生的ROS水平被抑制。當(dāng)我們用還原劑N-acetylcysteine5 mM處理細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，在“創(chuàng)傷-愈合”實(shí)驗(yàn)中，無論是kno

13、ckdown細(xì)胞還是對(duì)照組細(xì)胞，“創(chuàng)傷”兩側(cè)細(xì)胞內(nèi)的ROS被顯著下調(diào)，同時(shí)兩組之間細(xì)胞的向“創(chuàng)傷”遷移的活動(dòng)受阻。Cell invasion assay顯示，加入N-acetylcysteine后，knockdown細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞侵入活動(dòng)也被明顯的抑制，都只有原來的20％左右。這表明OLA1-knockdown后，對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵入能力的抑制很可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的ROS水平來實(shí)現(xiàn)的。
　　 結(jié)論與創(chuàng)新：
　　 1.

14、本研究首次發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)的負(fù)調(diào)控因子-OLA1，它對(duì)細(xì)胞內(nèi)抗氧化機(jī)制具有特異的調(diào)節(jié)性，主要是針對(duì)細(xì)胞內(nèi)的還原型巰基的動(dòng)態(tài)平衡。
　　 2.本研究發(fā)現(xiàn)了新的抗氧化調(diào)節(jié)機(jī)制，證明OLA1對(duì)細(xì)胞抗氧化機(jī)制的調(diào)節(jié)是通過蛋白翻譯后調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的，而不像大部分的調(diào)節(jié)途徑需要從基因轉(zhuǎn)錄開始，因而反應(yīng)更迅速。
　　 3.本研究首次發(fā)現(xiàn)因?yàn)镺LA1被knockdown之后，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的遷移和侵入能力被抑制，轉(zhuǎn)移能力下降，并且