蠟梅Patatin-like蛋白基因CpPLP的克隆與功能的初步分析.pdf

1、Patatin-like蛋白作為一種新發(fā)現(xiàn)的脂肪分解酶家族，具有酯酰水解酶(Lipidacyl hydrolase;LAH)、酯酶和酰基轉(zhuǎn)移酶（蠟合酶）的活性。目前的研究初步表明，Patatin-like蛋白的酯酰水解酶和蠟合酶活性不僅是植物防御病蟲害的一種手段，而且還能提高植物應(yīng)對干旱脅迫的能力。
　　 本實驗在已經(jīng)構(gòu)建好的蠟梅花cDNA文庫及EST分析的基礎(chǔ)上，隨機克隆出蠟梅Patatin-like蛋白基因，命名為蠟梅CpP

2、LP基因，對其進行序列特征和生物信息學(xué)的分析，對CpPLP基因在蠟梅的不同組織和不同花期中的表達特異性進行熒光定量PCR分析，并構(gòu)建植物表達載體，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，對CpPLP基因的生理功能進行進一步的分析驗證。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1、CpPLP基因的分子特征及生物學(xué)分析
　　 CpPLP基因eDNA全長1489bp，其中ORF框為1131bp，編碼376個氨基酸。在NCBI上對其保守

3、結(jié)構(gòu)域的分析發(fā)現(xiàn)，CpPLP基因編碼的蛋白具有Patatin-like蛋白家族的特征。對其序列結(jié)構(gòu)的分析顯示:該基因編碼的蛋白的相對分子質(zhì)量為41122.5，等電點為4.84，其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋(Alphahelix，41.88％)、延伸鏈(Extended strand，22.65％)、無規(guī)卷曲(Random coil，29.06％)、β-轉(zhuǎn)角（Beta turn，6.41％）構(gòu)成;疏水性分析顯示該基因所編碼的蛋白具有較好的親水

4、性。
　　 2、CpPLP基因表達的轉(zhuǎn)錄水平分析
　　 通過對蠟梅CpPLP基因的實時熒光定量PCR分析表明:在不同組織中，CpPLP基因在蠟梅的花器官中尤其是在雄蕊中的表達量最高，而在根、莖、葉以及雌蕊中幾乎沒有表達，表明CpPLP基因具有很強的組織特異性。CpPLP基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在雄蕊中最多，推測該基因與雄蕊的形態(tài)建成有關(guān)，保護雄蕊免受外界病蟲或者機械損傷的侵害;而對不同花期的熒光定量分析顯示，CpPLP基因主要是在

5、露瓣期及其以后表達，在盛開期的表達量達到最高，而在萌動期和蕾期則微量表達，此結(jié)果進一步確認了CpPLP基因?qū)χ参锘ǘ溆绕涫切廴锷L發(fā)育具有保護作用;而在干旱脅迫下的熒光定量分析則顯示，CpPLP基因的表達量明顯上升，表明CpPLP基因能幫助植株起到保水的效果，有利于植株及花粉的發(fā)展及生長，在疏水條件下有助于植株存活。
　　 3、CpPLP基因植物表達載體構(gòu)建及煙草的遺傳轉(zhuǎn)化
　　 構(gòu)建CpPLP基因的植物表達載體，采用電

6、轉(zhuǎn)法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中。再采用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，通過Km+抗性篩選、GUS染色、轉(zhuǎn)基因煙草DNA的PCR檢測和RNA檢測以及對轉(zhuǎn)基因煙草的實時熒光定量PCR檢測，得到5個株系的轉(zhuǎn)基因煙草，其中每個株系擴繁得到15株轉(zhuǎn)基因植株，用于后續(xù)功能驗證。對轉(zhuǎn)基因煙草和對照野生煙草的可溶性蛋白含量和LAH活性進行分析，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的可溶性蛋白含量和LAH活性均高于野生煙草。
　　 4、轉(zhuǎn)基因煙草的抗性分析
　　 對轉(zhuǎn)基

7、因煙草進行抗病性和抗逆性試驗，并對其進行抗病性（病毒病、細菌病和真菌病）和抗旱性方面的檢測。
　　 通過用半葉枯斑法將煙草花葉病毒(TMV)轉(zhuǎn)入供試煙株中，對照野生型煙草的病癥較轉(zhuǎn)基因煙草植株更嚴(yán)重。通過傷根灌菌液法接種細菌類病菌煙草青枯病菌，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草與野生型對照煙草均有青枯病癥狀出現(xiàn)，但相較野生型對照煙草，轉(zhuǎn)基因煙草的病癥比較輕。通過葉片噴霧法接種真菌病煙草白粉病，結(jié)果顯示相對野生型煙草，轉(zhuǎn)基因煙草的癥狀較輕，沒有出