毒力蛋白Apyrase和染色體編碼的亞復(fù)方物形成毒力復(fù)合物對(duì)細(xì)菌胞間擴(kuò)散的影響.pdf

1、志賀氏菌（Shigella flexneri）5a M90T是一類具有高度傳染性和嚴(yán)重危害的革蘭氏陰性桿菌，是導(dǎo)致人類腹瀉的最為常見(jiàn)的病原菌。比較基因組學(xué)表明志賀氏菌可能是由非致病性大腸桿菌通過(guò)趨同進(jìn)化而來(lái)，并且通過(guò)基因水平轉(zhuǎn)移獲得了一個(gè)毒力大質(zhì)粒從而變成致病菌。志賀氏菌在致病過(guò)程中所需的大多數(shù)蛋白都是由毒力大質(zhì)粒編碼的，包括膜蛋白復(fù)合物Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)。本課題要考察的是，在志賀氏菌的細(xì)胞膜上是否還有其它毒力相關(guān)膜蛋白復(fù)合物呢？

2、
　　為了回答這個(gè)問(wèn)題，我們利用BN/SDS-PAGE比較志賀氏菌5aM90T野生株和毒力大質(zhì)粒缺失株的膜蛋白復(fù)合物譜，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)野生株特有的膜蛋白復(fù)合物，將之命名為M90T-290。然后通過(guò)SDS-PAGE分離和質(zhì)譜鑒定M90T-290的蛋白組成，發(fā)現(xiàn)它是由大質(zhì)粒編碼的Apyrase和染色體編碼的C1pB、DnaK、YdgA、EF-TU、GapA組成。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，其中兩個(gè)組成蛋白Apyrase和DnaK都與毒力蛋白VirG的極

3、性分布有關(guān)。推測(cè)膜蛋白復(fù)合物M90T-290是毒力相關(guān)的膜蛋白復(fù)合物。
　　本文通過(guò)提取復(fù)合物各亞基的缺失突變株天然結(jié)構(gòu)的膜蛋白復(fù)合物，BN-PAGE分離膜蛋白復(fù)合物，觀察BN-PAGE條帶的變化，發(fā)現(xiàn)△ydgA、△phoN2、△dnaK較野生株缺少了M90T-T290，△c1pB并不影響M90T-290的形成。說(shuō)明Apyrase、DnaK、YdgA是膜蛋白復(fù)合物M90T-290的必需組成成分，C1pB不是M90T-290組成成分

4、。為了進(jìn)一步確定復(fù)合物各亞基的相互作用關(guān)系，利用Pull-down實(shí)驗(yàn)分析，結(jié)果表明復(fù)合物各亞基間存在廣泛的兩兩相互作用。
　　然后考察了M90T-290是否影響細(xì)菌的毒力。通過(guò)HeLa細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)和豚鼠角膜實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生株和相應(yīng)的回復(fù)株相比，缺失了復(fù)合物M90T-290的突變株△ydgA、△phoN2、△dnaK的毒力明顯減弱，表明復(fù)合物M90T-290是福氏志賀氏菌5a M90T的發(fā)揮毒力功能所必需的。
　　復(fù)合物M9

5、0T-290是否通過(guò)影響VirG極性分布和宿主細(xì)胞中actin的聚集發(fā)揮毒力呢？為了回答這個(gè)問(wèn)題，利用免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析了復(fù)合物各亞基缺失株對(duì)VirG極性分布和宿主細(xì)胞中aetin聚集的影響。結(jié)果顯示在△phoN2、△dnaK中VirG不能極性分布，而△ydgA中VirG仍以極性分布。這說(shuō)明Apyrase和DnaK這兩個(gè)蛋白是VirG的極性分布所必需的,跟是否形成復(fù)合物沒(méi)有關(guān)系，即復(fù)合物M90T-290存在與否不影響VirG的極性分布。<

6、br>　　志賀氏菌缺失phoN2、dnaK和ydgA后，聚集actin的能力喪失，進(jìn)而無(wú)法在胞內(nèi)和胞間擴(kuò)散。產(chǎn)生這種結(jié)果有兩種可能的機(jī)制:1、Apyrase、 DnaK和YdgA形成復(fù)合物影響aetin的聚集;2、其中某個(gè)蛋白影響了actin的聚集，另外兩個(gè)蛋白影響這個(gè)蛋白的表達(dá)調(diào)控。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明phoN2、dnaK和ydgA不存在表達(dá)調(diào)控關(guān)系，排除了第二種可能性，說(shuō)明是Apyrase、 DnaK和YdgA形成復(fù)合物影響actin

7、的聚集。
　　最后，通過(guò)對(duì)志賀氏菌膜蛋白復(fù)合物圖譜的進(jìn)一步分析和質(zhì)譜鑒定，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)由染色體編碼蛋白DnaK、YdgA、EF-TU和GapA形成的亞復(fù)合物，命名為M90T-260。這個(gè)亞復(fù)合物M90T-260的形成不依賴于毒力蛋白Apyrase，并且在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都可以結(jié)合重組表達(dá)的Apyrase形成的全復(fù)合物M90T-290。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)福氏志賀氏菌（Shigella flexneri）5aM90T所特

8、有的膜蛋白復(fù)合物M90T-290，由毒力蛋白Apyrase結(jié)合染色體編碼的亞復(fù)合物形成，后者由DnaK、YdgA、EF-TU和GapA蛋白組成。該復(fù)合物的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒力的降低。其發(fā)揮毒力的機(jī)制是與另一個(gè)毒力蛋白VirG協(xié)同影響actin的聚集，促進(jìn)志賀氏菌在胞內(nèi)和胞間擴(kuò)散。本研究不但發(fā)現(xiàn)了志賀氏菌毒力相關(guān)的膜蛋白復(fù)合物，初步闡述毒力機(jī)制，而且作為首次發(fā)現(xiàn)的染色體與毒力大質(zhì)粒編碼蛋白形成復(fù)合物協(xié)同發(fā)揮毒力功能的例子，為志賀氏菌染色體與