鼠疫菌和志賀菌毒力大質(zhì)粒對細菌蛋白表達譜的影響.pdf

1、志賀氏菌（Shigella），又稱痢疾桿菌，是一類無鞭毛，不形成芽孢的革蘭氏陰性桿菌，為人類細菌性痢疾的主要病原體。鼠疫耶爾森氏菌是一類有莢膜，無鞭毛，不形成芽孢的革蘭氏陰性短桿菌，是鼠疫的病原菌。Ⅲ型分泌系統(tǒng)是某些革蘭氏陰性病原菌所具有的一種特殊細胞結(jié)構(gòu)，志賀氏菌和鼠疫耶爾森氏菌都具有Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)跨越病原細菌的內(nèi)膜、外膜及宿主細胞膜。細菌內(nèi)合成的蛋白質(zhì)通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)結(jié)構(gòu)分泌到宿主細胞中，這些蛋白在病原菌侵襲宿主以及宿主

2、致病過程中發(fā)揮重要作用。在這兩種細菌中，Ⅲ型分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)組成蛋白及效應分子，均由一類進化過程中外源獲得的毒力大質(zhì)粒編碼。
　　本文對兩種不同的病原菌進行對比分析。眾所周知，細胞內(nèi)的大多數(shù)蛋白通常要和其它蛋白相互結(jié)合并相互調(diào)節(jié)，最終形成蛋白復合物來行使其功能。非變性凝膠電泳(BN-PAGE)，在分離蛋白質(zhì)復合物的時候，能夠保持蛋白的生物學活性。在蛋白復合物分離以及蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用等多個領(lǐng)域研究發(fā)揮了重要作用。本研究首先采用B

3、N-PAGE方法從毒力編碼Ⅲ型分泌系統(tǒng)質(zhì)粒缺失突變株和野生株的全菌復合物蛋白及膜復合物蛋白的對比中，發(fā)現(xiàn)志賀氏菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)毒力質(zhì)粒缺失與谷氨酸脫羧酶及ATP合成酶的復合物形成有關(guān)，而在鼠疫耶爾森氏菌中，并未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。隨后，我們希望從蛋白質(zhì)組水平分析鼠疫菌毒力大質(zhì)粒對細菌表達譜的影響，并與福氏志賀氏菌中的類似研究進行對比，以期闡明兩種細菌在毒力質(zhì)粒表達調(diào)控中的異同。本研究通過雙向電泳技術(shù)與質(zhì)譜分析相結(jié)合的方法，比較了鼠疫缺失編碼Ⅲ型

4、分泌系統(tǒng)的質(zhì)粒缺失菌株和野生株在26℃和37℃培養(yǎng)條件下的蛋白表達差異，成功分離并鑒定了鼠疫耶爾森氏菌野生株和毒力大質(zhì)粒缺失突變株中的差異蛋白，其中26℃條件下鑒定到29個差異蛋白，37℃條件下鑒定到25個差異蛋白，其中包含7個由pCD1質(zhì)粒編碼的蛋白。但沒有檢測到與谷氨酸脫羧酶及ATP合成酶有關(guān)的蛋白表達變化。這些差異蛋白中僅有2個與志賀氏菌中的報道相符，說明兩種細菌的基因調(diào)控模式存在顯著差異。此外，針對前期研究發(fā)現(xiàn)的表達量受毒力大質(zhì)

5、粒調(diào)控的志賀氏菌谷氨酸脫羧酶，我們構(gòu)建了相應的基因突變株并對其編碼基因的調(diào)控進行了初步研究。由于谷氨酸脫羧酶存在兩種同工酶，我們利用λ-Red重組系統(tǒng)分別構(gòu)建了單缺失及雙缺失基因突變株，為進一步研究同工酶的功能奠定了基礎。同時利用磁珠捕獲及質(zhì)譜鑒定的方法，對谷氨酸脫羧酶可能的調(diào)控蛋白進行了初步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除已報道的調(diào)控蛋白H-NS外，StpA、RuvA也可能參與了谷氨酸脫羧酶的調(diào)控。綜上所述，志賀氏菌和鼠疫耶爾森氏菌都具有Ⅲ型分泌系